Тюнинг т: кабины своими руками, модернизации механики, шумоизоляция, установка кондиционера, дворники

кабины своими руками, модернизации механики, шумоизоляция, установка кондиционера, дворники

Трактор типа Т-150 имеет 2 модификации — на гусеницах и колесах. Техника адаптирована для движения по полям и асфальтобетонным дорогам. Ее серийное производство начали в 1973 г. Спустя 10 лет появились первые тюнингованные версии. Владельцы трактора пытались выделиться: меняли оплетки на руль, обшивку салонов, устанавливали зеркала другой формы. Тюнинг Т-150 все еще набирает популярность у кастомайзеров.

Исходные характеристики трактора

Унифицированный Т-150К должен быть особенным — так решили разработчики и установили дизельный, четырехконтактный двигатель, оснащенный 6 цилиндрами. Угол развала 60°. Там же расположены выпускные коллекторы и турбовый компрессор. При поступлении воздуха в цилиндр повышается мощность, но не увеличивается удельный расход солярки. Мощность двигателя — 165 л. с. Бензиновый двигатель в первоначальной версии запускал электростартер. Позже трактор Т-150 оснастили ДВС ЯМЗ.

Коробка передач имеет 4 диапазона:

• транспортный;
• замедленный;
• задний ход;
• рабочий.

Каждый позволяет включать 4 передачи. На всех колесах — колодочные тормоза, на валу переднего моста — ленточный стояночный тормоз. Передние и задние рамы соединены вертикальными и горизонтальными шарнирами.

Благодаря усиленной базе и колесам идентичного размера увеличивается грузоподъемность и появляется возможность агрегатировать с трактором большее количество техники.

Габариты:

• длина 0 6130 мм;
• ширина — 2400 мм;
• высота — 3195 мм.

Кабина Т-150К специально обустроена в зоне центра тяжести. Это предотвращает вибрацию. В салоне предусмотрена отопительная и вентиляционная системы. Оператор надежно защищен от посторонних шумов и пыли. Кабина двухместная, комфортабельные кресла на рессорах регулируются под вес и рост машиниста.

Чем можно дополнить

Некоторые владельцы тракторов подобного типа дорабатывают систему шумоизоляции, устанавливают современные кондиционеры, меняют дверные резинки, дворники. На стекла наносят тонировку, на корпус — стробоскопы и светодиодные маяки, а также переделывают коробку, усиливая ее.

Модернизация механики

Наиболее популярные способы модернизации механики на тракторе Т-150 можно разделить на этапы:

1. Усовершенствовать коробку. Многие усиливают третью передачу.
2. Усилить сцепление. Для этого меняется корзина сцепления и диск .
3. Оснастить комплектом для сдваивания колес. Он обеспечит лучшее сцепление с поверхностью, потому что площадь контакта станет больше
4. Учитывая, что трактор уже имеет турбонаддув, повысить мощность можно заменой двигателя.
5. Установить интеркулер. Это система дополнительного охлаждения воздуха, поступающего в цилиндры.
6. Поменять настройки аппаратуры, т. е. увеличить подачу топлива. Расход дизеля возрастет, но уменьшится ресурс двигателя.
7. Поставить гидравлический насос более высокой производительности. Это еще больше увеличит грузоподъемность трактора.

Как тюнинговать кабину своими руками

Вместо привычных фар можно установить галогеновые, вместо сигнальных маяков — мигалки и стробоскопы. Такая техника точно привлечет внимание. Цвет корпуса может быть разным: синим, красным, желтым. Кто-то добавляет металлические оттенки.

Для защиты от ультрафиолета поможет тонировка.

Но эксперты рекомендуют качественную атермальную пленку. Она дороже привычной черной, но при проведении замеров «ТОНИКом» выдает допустимый процент прохождения света. На солнце переливается всеми цветами радуги. Дополнительный эффект придает синяя подсветка в колпаках (желательно от МАЗ) и подножках. Если установить камазовские стоп-сигналы, внешний вид корпуса преобразится. Дополнительно подсвечивают государственный номер.

Можно обустроить стильный салон, задекорировав приборную панель вставками из кожи рептилий, а тканевую обшивку на сиденье заменить на мех или кожу.

Дверь и потолок рекомендуют обшить карпетом. Этот материал хорошо тянется, практически не рвется, создает дополнительный звукоизоляционный эффект. Его легко приклеить своими руками к поверхности с помощью клея ПВА. Наиболее выигрышно смотрится черный и бежевый карпет.

Декор ручника — неотъемлемая часть тюнинга. Не лишним будет заламинировать его карбоном, который представляет собой углеволокно, состоящее из мельчайших полимеров. Такую же технологию используют для модернизации дверных ручек.

Масштабная приборная панель — простор для фантазии. Поместится магнитола, DVD с высокоточным монитором, сабвуфер. Важно установить 3 антенны: для радио, телевидения и рации. Во время отдыха кабина превратится в кинотеатр либо караоке-бар.

На стенах и потолке некоторые размещают светодиодную ленту. Она меняет цвета в зависимости от выбранного режима. Подключать можно с пульта ДУ.

После тюнинга рекомендуется согласовать изменения в конструкции с Госавтоинспекцией. В противном случае владельцу трактора Т-150 тюнинг кабины может дорого обойтись. Вряд ли удастся избежать протоколов и штрафов.

MORENDI | Чип тюнинг двигателя

Всего найдено:
7

Stage 1 Мощность (л. с.) до 115 после 145 результат + 30 Крутящий момент (Нм) до 250 после 310 результат + 60

Stage 1 Мощность (л. с.) до 115 после 130 результат + 15 Крутящий момент (Нм) до 200 после 240 результат + 40

Stage 1 Мощность (л. с.) до 150 после 175 результат + 25 Крутящий момент (Нм) до 250 после 300 результат + 50

Stage 1 Мощность (л. с.) до 150 после 195 результат + 45 Крутящий момент (Нм) до 320 после 430 результат + 110

Stage 1 Мощность (л. с.) до 190 после 220 результат + 30 Крутящий момент (Нм) до 380 после 450 результат + 70

Stage 1 Мощность (л. с.) до 190 после 235 результат + 45 Крутящий момент (Нм) до 320 после 400 результат + 80

Stage 1 Мощность (л. с.) до 300 после 350 результат + 50 Крутящий момент (Нм) до 380 после 460 результат + 80

Нажмите сюда, чтобы добавить описание

Тюнинг для Aveo T250. Студия тюнинга R&K Styling

Бампер задний R&K- Т250

Бампер задний R&K Nova для T-250

Бленда для Aveo T-250

Бровки (A ly XENON) для Aveo Т-250

Бровки верхние (широкие) для Aveo Т-250

Верхняя планка на капот для Aveo Т-250

Воздухозаборник на капот для Aveo T-250

Капот (Stealth) для Aveo Т-250

Клыки (уголки- накладки) на передний бампер Aveo Т-250

Клыки SD на передний бампер Aveo Т-250

Лип спойлер для Aveo Т-250

Спойлер для Aveo Т250

Спойлер для Aveo Т250 (Lancer style)

Накладка на передний бампер (губа R&K)

Накладка на задний бампер (губа R&K)

Реснички на фары Т250 верхние

Реснички на фары Т250 нижние

Накладки на задние фары (Косынки) Т250

Пороги (волна) Т250

Накладка на задний бампер (под клыки)

Решётка радиатора GR Т250

Решётка радиатора от R&K Т250

Передний бампер R&K Nova Т250

Пороги R&K Nova Т250

Накладка на передний бампер (GR) Т250

Накладка на задний бампер  Т250

Пороги (GR) Т250

Лип спойлер от R&K для Aveo Т-250

Накладка на задний бампер (GR) Т250

Доброго времени суток Уважаемые посетители нашего интернет-магазина и не посредственно этой страницы где мы предложим вам любой каприз по вашему усмотрению.
Все изделия по тюнингу Chevrolet Aveo T-250 были разработаны и воплощены в жизнь непосредственно нашими специалистами.
Так как ниша по тюнингу Chevrolet Aveo была свободна и были некоторые попытки сделать какой то вменяемый выбор, но все пред идущие работы так и канули в лета.
Наши специалисты разработали для вас массу всевозможных вкусняшек по тюнингу Шевроле Авео.
Здесь Вы можете сами составить свой образ вашего автомобиля так как мы предлагаем Вам всевозможные девайсы для вашего друга Chevrolet Aveo T-250.
Здесь вы можете скомпоновать всё что вам представится интересное для стайлинга. Мы предлогаем вам всевозможные реснички, пороги,накладки ( юбки ) на бампера, сами бампера, спойлера и многое другое.
Вы можете так же приобрести обвес-комплекты ( это специально сделано для вашего удобства )
Администрация сайта желает Вам приятных покупок в нашем интернет-магазине.

Главная | ZoneTuning.ru

На сайте представлены элементы внешнего тюнинга (производство Польша, Россия и страны Прибалтики) для Вашего автомобиля. Товар в наличии и на заказ (от 5 дней),в зависимости от искомой позиции. 

Все элементы тюнинга выполнены из качественного многослойного стеклопластика. Имеют высокую ударопрочность (не уступающую пластику) и морозоустойчивость. Требуют МИНИМАЛЬНОЙ подгонки при установке. Изготовлены по матрицам ОРИГИНАЛЬНЫХ обвесов, т.е.по сути являются качественными репликами. Наш склад находится на территории г.Москвы(ЮВАО). Возможна установка и покраска в нашей мастерской..

Внешний тюнинг авто

Хотим поговорить именно о ВНЕШНЕМ ТЮНИНГЕ АВТО иностранного производства. А также о продукции, которая подпадает под это понятие. За время нашего участия в ТЮНИНГ движении столицы и регионов РФ появились некие мысли, наблюдения и советы, которыми хочу поделиться тем, кому это интересно или актуально на сегодняшний день.

На сегодняшний день достаточно большое количество фирм, фирмочек, компаний и автосервисов занимается АВТО ТЮНИНГОМ. У всех разный подход к клиентам и ценам.

Цена на ТЮНИНГ ОБВЕСЫ или его элементы складывается из расходов на грузоперевозку, оптом или в розницу приходит товар, стоимость аренды офиса, количества персонала. А также ОРИГИНАЛЬНЫЙ или НЕОРИГИНАЛЬНЫЙ ТЮНИНГ ОБВЕС Вам предлагают.

Первое отличие ОРИГИНАЛА от НЕоригинала- материал изделия. ОРИГИНАЛЬНЫЙ ТЮНИНГ ОБВЕС изготавливают из чистокровного пластика. Как правило производители оригинальных ОБВЕСОВ напрямую ответвляются от заводов-производителей авто. Например, тюнингом МЕРСЕДЕС БЕНЦ занимается ТЮНИНГ ателье BRABUS,AMG, BMW- изначально выпускал АВТО М-класса, устанавливая уже готовый ТЮНИНГ ОБВЕС М-STYLE, а также для спортивных соревнований изготавливали ТЮНИНГ ОБВЕСЫ CARZON,SCHNITZER и т.д.Оригинальные элементы ТЮНИНГА не требуют подгонки и доработки в малярных мастерских, имеют все возможные решетки, крепления, противотуманные фары и т. д. А самое главное имеют страну производителя непосредственно именно данного авто, на которое покупается ТЮНИНГ ОБВЕС. Казалось бы — всё прекрасно. НО!!! Куда же без «но»? Цена на данный ОРИГИНАЛЬНЫЙ ТЮНИНГ ОБВЕС достигает не одной тысячи евро. Что иногда бывает покрывает бюджет чуть ли не всего авто….Так что это удовольствие под силу исключительному ценителю своего «любимца».

Самым бюджетным для АВТО ТЮНИНГА является НЕОРИГИНАЛЬНЫЙ ТЮНИНГ ОБВЕС. Ничего страшного здесь абсолютно нет, сам наторговал уже сотню-другую позиций, клиенты довольны- и денег сэкономили и внешний вид АВТО преобразили(причем бывает получается красивее оригинала), поверьте, после грамотной установки и покраски отличит только специалист.

Качество ТЮНИНГ ОБВЕСА из СТЕКЛОВОЛОКНА зависит от количества материала, затраченного на изделие, опытности мастера и изношенности оборудования на фабрике производителя. Если матрица «свежая», то изделие получается ровное- без изъянов, неровностей и впадин.(срок службы одной матрицы-1. 5-2 года), если же ТЮНИНГ изделие с неровностями и следами замазанными шпатлевкой или стекловолокном — значит матрица уже «скончалась», а вам пытаются впарить некачественный товар, который будет требовать колоссальных усилий маляра по подгонке к машине. И поверьте, качественный СТЕКЛОПЛАСТИК(так его тоже именуют) имеет прочность и морозоустойчивость не ниже, чем пластик, например, на штатном бампере. Учтите, что скорость уравнивает всё — и пластик, и металл.(часто смешат вопросами про выживаемость данной конструкции при лобовом столкновении — бтр в помощь)).

Теперь о подгонке ТЮНИНГ изделий из стекловолокна. Если вас пытаются убедить аргументами типа «мамой клянусь» или «зуб даю» в том,что подгонка ваааабще не нужна — не верьте. В данном случае она(подгонка) либо «минимальная»,либо «требует подгонки»,либо «требует доработки»-последнее лучше обходить стороной, иначе рискуете поднять на этом варианте давление и нервы, а этот «тюнинг»в результате выбросите. В самом слове «подгонка» ничего страшного нет.

Владельцы рассматривают АВТО ТЮНИНГ по разным причинам. Кто то хочет выделить свою машину среди серой массы,кто то разбил штатный бампер и решил купить ТЮНИНГ БАМПЕР(что порой бывает дешевле и красивей),кто то собрался на уличные гонки, кто то просто любит себе находить занятия, всех причин не перечислить. Мания ТЮНИНГА засасывает как в болото. Как правило, поменяв один БАМПЕР, человек недолго думая, покупает другой, потом ТЮНИНГ ПОРОГИ, потом ТЮНИНГ СПОЙЛЕР и т.д.

Вариантов для ТЮНИНГА много, выбирай-не хочу.

варианты ТЮНИНГ ОБВЕСОВ на примерах.

Вы рассматриваете вариант- ТЮНИНГ ОБВЕС БМВ Е39 М-СТИЛЬ. Отличие данного ТЮНИНГ М — ПАКЕТА от ОРИГИНАЛЬНОГО ТЮНИНГ — ОБВЕСА лишь в том, что молдинги на ТЮНИНГ — БАМПЕР — литые(т.е.под покраску),как показала Московская практика съемные молдинги на ОРИГИНАЛЬНОМ М-БАМПЕРЕ исчезают уже на 2ю ночь)и начинается головная боль владельца по поиску новых(коих в Москве оооочень мало). А после покраски и установки отличия практически исчезают. Причем в неоригинальный ТЮНИНГ ОБВЕС М-СТИЛЬ вы можете устанавливать любые противотуманные фары на свой вкус и цвет(под КСЕНОН, либо под штатную лампочку).

Рассматривая ТЮНИНГ БМВ Е39,либо ТЮНИНГ БМВ Е34,либо ТЮНИНГ ОБВЕС БМВ Е36 и т.д.не забывайте, что каждый ТЮНИНГ ОБВЕС имеет свою форму и размеры. Так ТЮНИНГ ОБВЕС БМВ Е36 CARZONE, состоящий из следующих позиций: ТЮНИНГ БАМПЕР CARZONE ПЕРЕДНИЙ, ТЮНИНГ БАМПЕР CARZONE ЗАДНИЙ и ПОРОГИ CARZONE(комплект),есть смысл устанавливать при условии езды исключительно в городских условиях, т.к. данный ТЮНИНГ ОБВЕС достаточно серьезно уменьшает дорожный просвет Вашего АВТО.

Такие же рекомендации касаются ТЮНИНГ ОБВЕСА НА БМВ Е34 и Е39 под названием ТЮНИНГ ОБВЕС НА БМВ V.I.P. Neodezign.

Наиболее распространенным для повседневной езды считается ТЮНИНГ ОБВЕС М-СТИЛЬ и ТЮНИНГ ОБВЕС НА БМВ SCHNITZER.

ТЮНИНГ ОБВЕС НА VW GOLF,ТЮНИНГ VW PASSAT,ТЮНИНГ ОБВЕС MERCEDES, ТЮНИНГ ОБВЕС AUDI,ТЮНИНГ ОБВЕС PEUGEOT изначально являются демократичными и приспособленными под наши дороги. Включая в свой ТЮНИНГ не только полные ТЮНИНГ ОБВЕСЫ, но и отдельные позиции для ТЮНИНГА — ТЮНИНГ ЮБКА НА БАМПЕР,ТЮНИНГ РЕСНИЦЫ, НАКЛАДКА НА ЗАДНЕЕ СТЕКЛО и т.д.

В данном случае ТЮНИНГ ОВЕС надо устанавливать полностью, при замене лишь одного штатного бампера на ТЮНИНГ БАМПЕР, АВТО ТЮНИНГ будет выглядеть незаконченным.

Например, для ТЮНИНГ TOYOTA CELICA T23 существуют «демократичные» обвесы (не уменьшающие дорожный просвет) такие как ТЮНИНГ ОБВЕС TOYOTA CELICA BODY CLUB, или ТЮНИНГ ОБВЕС TOYOTA CELICA WEIL SAID.

А также «агрессивные» ТЮНИНГ ОБВЕСЫ- такие как ОБВЕС DART WEBBER SPORT или ОБВЕС APR PERFOMANCE.

Так же в качестве дополнений на штатные места вместо ТЮНИНГ ОБВЕСОВ можно устанавливать ТЮНИНГ ЮБКИ, ТЮНИНГ ПОРОГИ ТРД, СПОЙЛЕРА ТРД и как апофеоз- ТЮНИНГ КАПОТ СТЕКЛОПЛАСТИК.

Весь ТЮНИНГ легко устанавливается на штатные места. Способов креплений достаточно много. Особых познаний в мире АВТО-ТЮНИНГА для этого не нужно.  

Желаем, что бы все Ваши ТЮНИНГ идеи материализовались. Творите, меняйте облик своего АВТО и ловите восхищенные взгляды.

Чип тюнинг двигателя, диагностика и прошивка дизеля и бензинового двигателя автомобиля

Мы рады приветствовать Вас на официальном портале нашей компании, основной сферой
деятельности которой является высококачественная компьютерная диагностика и чип тюнинг двигателя в Нижнем
Новгороде, а так же профессиональная прошивка автомобилей, существенно повышающая эксплуатационные
характеристики авто, оснащенных бензиновыми моторами и дизелем.

Пропала динамика? Увеличился расход топлива? Двигатель работает с перебоями? Появился
посторонний шум при работе двигателя? У вас возможно вышел из строя катализатор (на бензиновых двигателях)
или неисправен клапан EGR и забит сажевый фильтр (на дизельных автомобилях).

Наши мастера – это опытные профессионалы, знающие все нюансы работы с самыми популярными на сегодняшний
день корейскими, японскими и европейскими автомобилями. Благодаря отличной материальной базе мастерских в
Нижнем Новгороде, помимо диагностики, мы готовы предложить полный спектр услуг, предоставляемых в рамках
чип-тюнинга авто:

Выполненные на базе центра нашей компании «Чип тюнинг» в Нижнем Новгороде диагностика, прошивка и
профессиональный chiptuning для бензиновых и дизельных двигателей – это гарантия безотказной и эффективной
работы Вашего автомобиля и возможность ощутить настоящую мощь мотора, спрятанного под его капотом.

Причины воспользоваться чип-тюнингом автомобиля

Что же подразумевается под чип-тюнингом автомобиля и когда стоит отдать предпочтение именно такому
варианту модернизации дизеля или бензинового двигателя авто в Нижнем Новгороде? Само словосочетание
«chiptuning» пришло к нам из английского языка. В переводе «chip» — это «микросхема», а «tuning» —
«настройка». Как и следует, исходя из самого названия, chiptuning заключается в оптимизации программного
кода контроллера системы управления ДВС путем внесения определенных изменений в стандартные заводские
настройки.

В отличие от других видов технического чип тюнинга, при модернизации подвергается исключительно
программное обеспечение авто, а не его узлы и системы, а потому нет необходимости в диагностике и
демонтаже элементов двигателя и замене его дорогостоящих комплектующих.

После модернизации тюнинговый автомобиль готов в полной мере раскрыть владельцу свой потенциал:

• После чиптюнинга двигателя существенно увеличивается мощность (в отдельных случаях удается достичь
  прироста в 40%).
• Улучшение динамики разгона.
• Снижение потребления топлива в бензиновом моторе и дизеле во всех режимах движения автомобиля.
• Повышение управляемости, которое выражается в динамичном отклике авто на нажатие педали «газ».
• Эластичность работы мотора на низких и средних оборотах.

Если Вы ищете, где сделать чип тюнинг дизеля и бензиновых двигателей, предлагаем
посетить наш автоцентр, где опытный мастер при помощи самой современной аппаратуры произведет диагностику
мотора и компьютерной системы контроля, а также выполнит модернизацию автомобиля на самом высоком уровне.
По всем вопросам и для предварительной записи обращайтесь по тел.: +7 (831) 413-22-87, +7 (920) 299-07-66,
также мы ждем Вас по адресу: г. Нижний Новгород, проспект Ленина 87.

Армянские Т-72 пройдут «спортивный» тюнинг

Армянский Т-72Б на «Танковом биатлоне»

Виталий Кузьмин / vitalykuzmin. net

Российская корпорация «Уралвагонзавод» проведет модернизацию основных боевых танков Т-72 сухопутных войск Армении. Как пишет газета «Известия», армянские танки будут улучшены до «спортивной» версии Б4, разработанной для участия в «Танковом биатлоне». Доработке подвергнутся несколько десятков машин. По официальным данным, на вооружении Армении стоят 101 танк Т-72.

Армения располагает устаревшими версиями танков Т-72 — А, Б и АВ, отличающихся друг от друга некоторыми бортовыми системами и защитой. Часть этих танков страна получила при выходе из состава СССР в августе 1990 года, а часть машин была поставлена Россией в 2013 году. За все время службы танки проходили капитальный ремонт и незначительную модернизацию.

Масштабная модернизация до версии Т-72Б4 позволит существенно улучшить боевые возможности армянских танков и увеличить срок их эксплуатации. Следует отметить, что прежде Армения планировала заказать модернизацию Т-72 у польской компании Bumar, но позднее передумала.

В рамках программы модернизации армянские Т-72 получат форсированные многотопливные двигатели, способные развивать мощность до 1130 лошадиных сил. Базовая версия такой силовой установки выдает только 1000 лошадиных сил. Форсирование движка без ущерба ресурсу стало возможно благодаря доработке его системы охлаждения.

Армянские Т-72 будут укомплектованы и новыми гусеницами, траки которых имеют специальный узор, существенно улучшающий сцепление с грунтом. Такие гусеницы позволяют повысить маневренность тяжелой боевой машины.

Модернизированные Т-72 получат и многоканальный прицел «Сосна-У» с тепловизионным каналом наблюдения и автоматом сопровождения цели. На машину установят и комплекс кругового обзора, благодаря которому командир танка сможет обнаруживать цели днем и ночью и передавать данные о них наводчику. Этот комплекс позаимствован из состава системы управления огнем «Калина» танка Т-90МС.

Другие подробности о модернизации армянских танков не сообщаются. Версия Т-72Б4 частично основана на варианте модернизации Т-72Б3М. Это означает, что помимо нового двигателя на армянские Т-72 при модернизации установят и новую автоматическую коробку передач АПП-172, способную работать как в автоматическом, так и в ручном режимах.

Проект модернизации также предполагает установку новой гладкоствольной пушки 2А46М-5 калибра 125 миллиметров и зенитного пулемета «Корд» калибра 12,7 миллиметра.

Т-72 является самым массовым послевоенным танком второго поколения. Разработанный в конце 1960-х годов танк стоит на вооружении 45 стран мира. Всего за годы производства были выпущены чуть более 30 тысяч таких машин, причем они собирались не только в СССР и России, но и в Югославии, Польше, Чехословакии и Индии.

Василий Сычёв

Чип-тюнинг двигателя в Москве и регионах — цены

Компания Reborn Technologies предлагает уникальные  решения по увеличению мощности и других параметров автомобилей путем чип-тюнинга двигателя с применением оригинального оборудования — программаторов.

Что такое чип-тюнинг?

Большинство современных систем впрыска автомобилей оборудуются электронным блоком управления, который хранит в себе информацию обо всех основных технических данных авто. Специальная программа следит за временем подачи топлива, изменением длины впускного коллектора, углом опережения зажигания и другими характеристиками. Однако на заводе устанавливается стандартная прошивка, не учитывающая особенностей стиля вождения каждого человека, дорожных и климатических условий, других нюансов. С помощью чип-тюнинга можно корректировать эти настройки, значительно меняя ходовые качества авто.

Зачем это нужно?

Чип-тюнинг двигателя в Москве от нашей компании, как правило, делают с целью: 

• увеличения тяговых характеристик и эластичности двигателя; 
• повышения отзывчивости педали газа, удаления «подвисаний» мотора; 
• снятия заводских программных ограничений. 

Благодаря нашим услугам, значительно улучшаются ходовые характеристики вашего авто.

Надежность и качество

Интересует качественный и надежный чип-тюнинг двигателя по разумной цене? Обращайтесь в компанию Reborn Technologies. Команда профессиональных специалистов из России, Бельгии и Германии предлагает клиентам только проверенные решения. В своей работе мы используем только оригинальные программаторы от ведущих разработчиков, гарантируя полную сохранность блока управления.

Новости

Доступен чип-тюнинг BMW i8

с 29 июня 2016 года один из наших партнеров заявил, что программисты откатали прошивку для увеличения мощности BMW i8. Теперь наша компания предлагает полноценный чип-тюнинг BMW i8….

Смотреть все новости

Services — R / T Tuning — Dyno Tuning & Engine Performance Specialists

R / T Tuning стремится быть лучшим магазином производительности в отрасли. От базовых деталей на болтах до изготовления и сборки двигателей; Вы можете поспорить, что R / T Tuning много раз делал свою работу и будет делать ее правильно!

Наша философия «бескомпромиссности» гарантирует, что готовый автомобиль, будь то уличный автомобиль, которым ежедневно управляют, или специально сконструированная гусеничная машина для удаления шин, превзойдет ваши ожидания.

* Dyno Tuning — R / T Tuning — один из немногих магазинов во всей стране, где есть дино 2WD DynoJet и AWD Mustang 500.Эти прецизионные машины находятся в собственной закрытой звукоизоляционной динамометрической ячейке с климат-контролем. Наши динамометрические ячейки регулярно калибруются и обслуживаются, чтобы обеспечить бесперебойную, безопасную и лучшую работу вашего автомобиля. Наши тюнеры авторизованы на заводе для:

• AEM EMS и Infnity
• A’PEXi Power FC
• Ecutek
• Haltech
• Hondata
• Тюнеры HP
• Motec
• SCT
• UpRev

Мы также гордимся тем, что являемся единственным авторизованным профессиональным дилером и профессиональным тюнером Cobb Tuning в нашем регионе. Это означает, что ваша машина получит лучшие запчасти, лучшую настройку и самый опытный персонал для обслуживания.

Наши сотрудники также имеют опыт работы со многими другими системами настройки, в том числе с открытым исходным кодом. Посетите нашу страницу Dyno для получения дополнительной информации.

* Установки — R / T Tuning — это магазин с полным спектром услуг, в котором можно установить все основные болтовые соединения, такие как впускные, выпускные трубы, понижающие пружины, тормоза и т. Д. Вы называете это — это не проблема.

* Установка нагнетателя и турбонагнетателя — От заводских турбо-модернизаций до принудительных индукционных преобразований R / T Tuning провела бесчисленное количество турбо-обновлений.Наша команда экспертов проконсультирует вас по поводу дополнительных модификаций и обеспечит максимальную управляемость и характеристики за свои деньги.

* Выравнивание и балансировка углов — «Специалист по заниженным автомобилям»: это не то название, которое хотят многие специалисты по выравниванию, но мы очень гордимся этим названием. Мы выполняем все наши регулировки на современной цифровой выравнивающей машине Hunter DSP6000 и терпеливо и осторожно загружаем автомобиль, не поцарапав и не повредив ничего.Кроме того, для балансировки углов мы используем весы Intercomp EZ. За последние несколько лет R / T получил признание за наши гоночные трассы: мы выполнили полные гонки для автомобилей, участвующих в Формуле D, Xtreme Drift Challenge (XDC), Global Time Attack, NASA Honda Challenge, Baja 1000 и многих других. другие события. Наш опыт в поддержке гусениц и настройке транспортных средств сделал нас идеальным местом для центровки для многих главных претендентов.

* Колеса и шины — R / T Tuning предлагает множество различных марок колес, включая Enkei, Volk, Work, BBS, SSR и многие другие.У нас также есть все ведущие бренды шин, а также несколько линий частных марок. Если вы ищете комбинацию колеса и шины для соревнований, или вам нужна идеальная комплектация колес, R / T Tuning поможет вам. Мы помогли бесчисленному количеству клиентов измерить их автомобили на предмет клиренса и подгонки колес, а также подобрать для них наилучший размер и вылет. Мы специализируемся на низкопрофильной и эластичной фурнитуре; не позволяйте этому знаменитому шинному магазину испортить вам колеса! Звоните нам!

* Suspension Tuning & Fender Rolling — R / T Tuning предлагает широкий выбор пружин, койловеров, амортизаторов, колесных проставок и регулировочного механизма от таких брендов, как Tein, Tokico, KW, ST, Stance, Eibach, KYB SPC, Cusco, BC Racing, Tanabe, Hotchkis, H&R, Megan Racing, Skunk 2 и многие другие.От начала до конца мы можем посоветовать вам подходящую подвеску для вашего автомобиля, установить, выровнять и настроить автомобиль для идеальной подгонки и производительности в соответствии с вашими потребностями. Кроме того, мы сами закатываем крылья для максимального снижения шума.

* Retail Speed ​​Shop — У вас есть собственные установки? С нами все в порядке, мы все еще можем вам помочь. В связи с отсутствием магазинов скоростного снаряжения в этом районе, R / T Tuning решила построить на нашем предприятии магазин скоростных автомобилей. У нас в наличии широкий ассортимент запчастей, аксессуаров и средств по уходу за автомобилем.Это позволяет вам получать запчасти в тот же день по тем же ценам, которые вы найдете в Интернете. Наши специалисты по запасным частям обладают опытом и знаниями, чтобы ответить на ваши вопросы и помочь вам получить лучшие запчасти для вашего автомобиля. Посетите нашу страницу скоростного розничного магазина для получения дополнительной информации о предлагаемых нами товарах.

Магазин работает с 9 утра до 6 вечера с понедельника по пятницу, телефон — 215-855-5565.

* 3M Защитная пленка для краски и краска для окон- В дополнение ко всем другим нашим услугам мы решили предложить нашим клиентам услугу по защите краски их автомобилей от ежедневного износа.Наша краска 3M предназначена для вашего автомобиля и защищает участки с высокой ударной нагрузкой от камней, дорожного мусора и других опасностей окружающей среды. Пленка практически невидима, чрезвычайно прочна, устойчива к пятнам / царапинам и не требует ухода. Защитная пленка 3M Scotchgard не выцветает и не желтеет, сохраняя краску вашего автомобиля в идеальном состоянии. Наша тонировка для окон 3M также является отличным способом защитить не только салон вашего автомобиля от вредных ультрафиолетовых лучей, но и ваши глаза, изменяя при этом внешний вид вашего автомобиля.Наш выбор оттенков для окон варьируется от обычного черного до цветостойкого и кристаллического.

* Ceramic Pro– Если вы хотите освежить, оживить или просто защитить свою краску, Ceramic Pro — правильный выбор для вашего автомобиля. Ceramic Pro — нанокерамическое покрытие номер один для защиты краски, которое имеет различные формулы для специального использования при нанесении краски. Эти покрытия специально разработаны в зависимости от того, будут ли они использоваться в качестве базового покрытия, верхнего глянцевого покрытия или для ежегодного обновления.

R / T Тюнинг | Монтгомеривилл, Пенсильвания

09.09.2015

Дорогой, постпродажный cust svc НЕ подходит, продавец по электронной почте, и парень, с которым я имел дело, не слушал или не мог прочитать одно из двух.

В июле 2015 года я проделал здесь работы на сумму более 2700 долларов. Я поставил 75% деталей.

Произошли 3 серьезные ошибки, даже несмотря на то, что я УКАЗЫВАЛ НА ЭТИ ДЕТАЛИ СПЕЦИАЛЬНО ДО ПОДАЧИ ИХ МОЙ АВТОМОБИЛЬ ДЛЯ РАБОТЫ. ЭТО В КОНЦЕ ЯВЛЯЮТСЯ ВЫДЕРЖКИ ИЗ ЭЛЕКТРОННОЙ ПОЧТЫ С RT:

«» Дело в том, что я отправил вам электронное письмо в начале всего этого, если вы помните.Я упомянул 3 вещи.

1. Я мог бы заплатить наличными, если бы это позволяло небольшую скидку. Если бы мне сказали о 2% комиссии, я бы заплатил наличными. Так как я не знал об этом до телефонного звонка, чтобы заплатить, я потерял возможность сэкономить деньги. Я бы сделал упор на оплату наличными, если бы знал о плате UPFRONT. В тот момент, когда вы упомянули об этом, прямо перед выставлением счета, я должен был отказаться от оплаты, пока я не смогу добраться туда, чтобы заплатить наличными. 50 долларов + долларов для меня того стоят, как я уже упоминал в начале всего этого.Я полагался на вас, чтобы сообщить мне об этом. Думаю, это моя вина.

2. Я упомянул о возможных шумах и скрипах, как о чем-то, на что нужно обращать особое внимание. Это происходит сейчас.

и,

3. Я хочу, чтобы все мое имущество в машине забрали с собой домой по завершении работы. Моя выхлопная труба пропала, и я снова узнал об этом только после того, как заплатил по телефону. В прошлые выходные у меня был покупатель, которого я мог бы потерять сейчас.

Вместо того, чтобы больше спорить с тобой, я съем это, у меня нет другого выбора.

Когда хорошее время, чтобы закончить? «»

Торговый представитель, с которым я столкнулся с парнем по электронной почте, которая была довольно плохой (Эрик Уилсон), я потратил почти 100 писем, пытаясь управлять ими, чтобы выполнить эту работу, пока я работал на FT и сдавал экзамены CPA (хорошо вещь сдал июльский экзамен). В конце концов, этот парень заставил меня почувствовать себя виноватым в том, что я не смог прийти в их рабочее время.

Я сказал ему, что мы должны спросить об этом владельца, и он сказал, что это нормально, но он в отпуске.

В этот момент я сократил свои убытки, так как стоимость этого опыта стала нецелесообразной.

Это дерьмо, с которым я рассчитываю мириться от механика-змейки на улице, а НЕ «тюнинговая мастерская», которая находится в часе езды туда и обратно от того места, где я живу, что мне пришлось сделать дважды. Я не должен был слушать моего друга, который направил меня в это место, потому что я вошел и задал парню запчастей (который великолепен) некоторые технические вопросы.

Никогда. Опять таки.

Как настроить TRX 2.5, 2.5R и 3.3 для достижения максимальной производительности

Настройка вашего
Двигатель TRX 2.5, 2.5R и 3.3 для лучшей производительности

Топливная смесь

Мощность двигателя зависит от топливной смеси. Переверните смесь
иглы по часовой стрелке для обеднения топливной смеси и против часовой стрелки для ее обогащения.
Обеднение топливной смеси увеличит мощность двигателя до
механические ограничения. Никогда не запускайте двигатель на слишком обедненной смеси (недостаточный расход топлива). Никогда не наклоняйте двигатель, пока он не начнет отключаться или глохнуть. Опираясь на
двигатель за пределы допустимых безопасных приведет к снижению производительности и
почти наверняка поломка двигателя. Признаки слишком бедной смеси
включают:

• Отключение или внезапная потеря мощности при разгоне.
• Перегрев (температура свечи накаливания выше 270 ° F)
• Из выхлопной трубы идет небольшой синий дым или он отсутствует.

Если какое-либо из этих условий присутствует, немедленно остановитесь и обогатите максимум
скорость смеси 1/4 об.Движок при этом, вероятно, будет немного богаче.
настройки, и затем вы можете настроить производительность. Всегда настраивайтесь на производительность
начиная с богатого и постепенно приближаясь к идеальным условиям. Никогда не пытайтесь настраивать
с худой стороны. Всегда должен идти легкий поток синего дыма
из выхлопа.

Перед тем как приступить к настройке, двигатель следует прогреть до нормального состояния.
рабочая температура и работа немного богатая. Все окончательные настройки
необходимо довести до нормальной рабочей температуры двигателя.Ты можешь сказать
двигатель работает на обогащенной смеси, учитывая любое из следующего:

• Вялый разгон с синим дымом из выхлопной трубы
• Автомобиль не может переключиться на вторую передачу (если установлена)
• Из выхлопной трубы разбрызгивается несгоревшее топливо
• Наклонение высокоскоростной топливной смеси увеличивает производительность

высокоскоростной
Регулировка топливной смеси

Базовая установка для высокоскоростной иглы =
четыре очереди из закрытых

При прогретом двигателе
и работая на богатой настройке, постепенно обедняйте высокоскоростную топливную смесь в
Шаг 1/16 оборота.Сделайте несколько скоростных проездов на машине после
каждую регулировку, чтобы очистить двигатель и отметить любые изменения в работе. TRX
гоночные двигатели чрезвычайно мощны. Не забывайте нажимать дроссель постепенно
во избежание подъёма или потери контроля. Продолжайте эту процедуру, пока
существует одно из следующих условий:

1. Больше нет улучшения производительности
2. Двигатель начинает глохнуть на высоких оборотах (Опасно!)
3. Произошла внезапная потеря мощности при разгоне (опасность!)
4. Двигатель начинает перегреваться.

Симптомы перегрева включают:

• Пар или дым от двигателя (не выхлоп)
• Колебание или глохнет при разгоне
• Лук или стук при торможении (детонация)
• Колебания холостого хода

Измерение температуры выше 270 ° F на свече накаливания Если любой из
выше условий, топливная смесь уже прошла максимально безопасную обедненную смесь
параметр. Обогатите топливную смесь до оптимальной настройки за счет обогащения высокой
скорость иглы не менее 1/8 оборота против часовой стрелки и повторите тест. Этот параметр будет
продлить срок службы компонентов двигателя.

Низкоскоростной
Регулировка топливной смеси

Базовая настройка иглы низкой скорости =
заподлицо с серым кольцом вокруг винта регулировки малой скорости
(см. рис. двигатель / отвертка выше)

Смесь низких оборотов всегда устанавливается после правильной регулировки иглы высоких оборотов.
тихоходная смесь будет установлена ​​с помощью щипкового теста.

1. Когда двигатель прогреется, сделайте несколько пробежек на высокой скорости, чтобы убедиться, что
   высокоскоростная игла установлена ​​правильно.
2. Завести автомобиль и защемить закрытый топливопровод, идущий в
   карбюратор. Двигатель должен поработать две-три секунды, разогнаться, а затем
   умереть.
3. Если двигатель работает дольше трех секунд, опустите иглу низких оборотов.
   1/16 оборота, сделайте еще несколько высокоскоростных пробежек и повторите тест.
4. Если двигатель сразу заглохнет без увеличения скорости, обогатите низкооборотный
   игла на 1/8 оборота, сделайте еще несколько пробежек на высокой скорости и повторите тест.

Когда игла низких оборотов установлена ​​правильно, реакция дроссельной заслонки двигателя
должно быть очень быстрым, возможно, даже до такой степени, что будет трудно сохранить
автомобиль от движения на заднем колесе при ускорении!

Скорость холостого хода
Регулировка

установки базы для праздных стопорного винта =
0.Зазор 5-1,0 мм между золотником
и внутренней частью впускного тракта карбюратора (трубка Вентури).

Когда-то высокий и
установлены тихоходные смеси, снизить обороты холостого хода до минимально надежных
холостой ход. Помните, что эту регулировку следует производить при включенном двигателе.
работает при нормальной рабочей температуре.

1. Поверните триммер дроссельной заслонки на передатчике так, чтобы сработали тормоза.
   Это гарантирует, что заслонка дроссельной заслонки упирается в регулировку холостого хода
   винт.
2. При необходимости снимите воздушный фильтр, чтобы получить доступ к регулировке холостого хода.
   винт.
3. Поверните винт против часовой стрелки, чтобы уменьшить скорость холостого хода, или по часовой стрелке, чтобы
   увеличить это. Скорость холостого хода следует установить как можно ниже, пока
   сохранение надежных ходовых характеристик.
4. Переустановите триммер дроссельной заслонки передатчика.

Примечание: Если установлена ​​частота вращения холостого хода
слишком высоко, это может помешать T-Maxx переключаться между прямым и обратным ходом.Если вы почувствуете это, просто уменьшите холостой ход.

Тонкая настройка
Карбюратор

После точной настройки двигателя TRX в конце процедуры обкатки нет
обычно необходимы серьезные корректировки топливной смеси. Обратите внимание на
температура, влажность и барометрическое давление на момент окончания штрафа
тюнинг карбюратора. Текущие погодные условия можно найти в Интернете по адресу
национальные веб-сайты, новостные сайты местных телеканалов и телевидения. Эта информация
будет считаться вашей базовой настройкой.

Возможно, вам потребуется отрегулировать иглы карбюратора, чтобы компенсировать изменения
температура и барометрическое давление (плотность воздуха) изо дня в день. В общем,
вам нужно будет обогатить топливную смесь, когда погода холоднее, чем ваша
базовая температура и плотность воздуха выше. Обедните топливную смесь, когда
погода теплее, чем ваша базовая температура, а плотность воздуха ниже.
В таблице ниже приведены общие рекомендации по влиянию погодных условий на
плотность воздуха, когда они движутся выше или ниже вашей базовой настройки.

Регулировка периода полужизни лиганда на основе света поддерживает кинетическую корректирующую модель передачи сигналов Т-клеток

Резюме:

В этой системе домен Lov2 связывает Zdk1 с низким нМ Kd в темноте и низким мкМ Kd в интенсивном синем свете. Интенсивный синий свет вызовет быстрое преобразование в форму с низким сродством, а более тусклый синий свет вызовет более медленное преобразование (даже когда Zdk1 связан), и некоторая степень восстановления темноты этих молекул уравновесится до концентрации активного Lov2, который связывает Zdk1 и диссоциирует с ak _off определяется интенсивностью света. Домен Lov2 прикрепляется к поддерживаемому липидному бислою (SLB) с помощью флуорофора, а домен Zdk1 (небольшой трехспиральный пучок на основе повтора протеина A) экспрессируется как CAR первого поколения. Система циклически переключается между темным / тусклым (связывание включено) или светлым (связывание выключено) состояниями с периодами темноты / тусклости, что приводит к увеличению распространения клеток. Даже в светлом состоянии область контакта сохраняется, вероятно, за счет низкоаффинного взаимодействия выключенного Lov2 с Zdk1. В качестве считывания авторы в основном сосредотачиваются на считывании датчика DAG, поскольку считывание ZAP-70 для самого автомобиля, похоже, набирается в простой пропорции к включению (даже в состоянии света / выключения?).Сигнал репортера DAG пропорционален кинетике, а не занятию. Предполагается, что этап между ITAM-опосредованным рекрутированием ZAP-70 и LAT-зависимым рекрутированием PLCγ (на основе литературы) может быть задействован в кинетической корректуре с порогом около 10 секунд.

Как технический документ, посвященный разработке инструмента, это интересный документ, который может быть опубликован в разделе «Инструменты и ресурсы». Документ больше относится к синтетической биологии и разработке методов лечения на основе CAR, но имеет ограниченное отношение к тому, как работает TCR или само / несамо-дискриминация.Мы не думаем, что статья решает последний вопрос, на который поставили себя авторы. Необходимо решить ряд технических вопросов, касающихся метода. Более того, что несколько беспокоит, обширная литература в данной области цитируется выборочно. Ниже мы даем рекомендации по обоим этим важным вопросам.

Мы хотели бы поблагодарить вас и других рецензентов за содержательные и конструктивные отзывы. Эксперименты и ссылки на литературу, которыми вы поделились, помогли сделать нашу статью более сильной и понятной.Мы изложили наиболее важные изменения в приведенном ниже документе и отдельно предоставили подробный ответ по каждому пункту.

1) Рецензенты хотели, чтобы мы более четко сфокусировались на нашем использовании CAR, как при настройке, так и при интерпретации наших результатов. Во время пересмотра мы внесли изменения в рукопись, чтобы более четко подчеркнуть, что мы используем CAR. Мы включили сравнения с историческими данными о химерных антигенных рецепторах и возросшую медицинскую значимость понимания их сигнальных механизмов.Интерпретируя наши результаты, мы четко очерчиваем, какие выводы применимы к передаче сигналов CAR, а какие могут быть более общими особенностями передачи сигналов Т-клеток.

2) Экспериментально рецензенты хотели получить более подробное описание характеристик нашей новой системы, особенно с точки зрения абсолютного числа молекул. К счастью, мы смогли обсудить все их вопросы. Абсолютная количественная оценка уровней CAR на клеточной поверхности (62-238 x10 ³ молекул / клетка) и плотностей LOV2 (между 40-1200 молекул / мкм ² ) показала, что наша система работает в тех же молекулярных диапазонах, что и ранее опубликованные CAR. -основанные подходы.Изображения с большим увеличением показали, что оба наших репортера локализовались, как и ожидалось: ZAP70 совместно локализовался с областями занятости CAR, в то время как DAG был обнаружен примерно диффузно по всему следу клетки. Чтобы устранить опасения по поводу неточного заполнения рецепторов в результате исключения несвязанных молекул LOV2 из следа клетки, мы повторно проанализировали наши данные в соответствии с наихудшим сценарием: все несвязанные молекулы LOV2 исключены из следа. В этих условиях мы обнаруживаем, что наше значение n увеличивается с 2.7–7,0, что указывает на консервативную оценку наших опубликованных результатов.

3) Рецензенты хотели большего количества сравнений между нашим подходом и результатами с другими статьями в этой области. С этой целью они предложили включить несколько отличных статей. Мы включили эти и другие ссылки в нашу пересмотренную заявку. Это помогло укрепить нашу статью и дать читателю более широкий кругозор, предоставив больше точек для сравнения как в настройке нашего подхода, так и в обсуждении результатов. Мы ценим, что они нашли время поделиться конкретными конструктивными отзывами, которые позволили нам легко понять их проблемы и напрямую решить их.

Существенные изменения:

1) Краткое содержание и Введение должны быть изменены, чтобы отразить больше фона CAR и различения лигандов Т-клеток и того, что может научить нас упрощенная модель передачи сигналов с кинетическим контролем на основе света.

В качестве мотивации для нашего экспериментального подхода мы более сильно подчеркнули преимущества синтетических входных данных на основе CAR.Простая модульная конструкция CAR упрощает конструирование с помощью нашего оптогенетического подхода и позволяет обойти многие механизмы, которые эндогенный TCR может использовать для различения лигандов. Тот факт, что мы наблюдаем кинетическую корректуру с более минимальным CAR, накладывает ограничения на возможные рецепторные механизмы, которые способствуют определению продолжительности связывания лиганда. Непосредственно контролируя период полужизни связывания лиганда с помощью простого рецептора в сочетании со считыванием живых клеток на разных уровнях пути, мы можем лучше изолировать и изучить степень, в которой проксимальный путь передачи сигналов помогает в кинетическом различении лигандов.

2) Многие аспекты системы плохо описаны — на данный момент в технологиях, с которыми они работают, они должны предоставить:

Мы согласны с тем, что более тщательная количественная оценка нашей системы поможет читателям интерпретировать наши результаты, а также поможет в воспроизведении нашей работы другими. Ниже мы рассмотрели все экспериментальные проблемы.

a) Абсолютное количественное определение (количество молекул / клетка) CAR на клетках Jurkat.Это может быть сделано с помощью проточной цитометрии с 488 или 640 метками Luv2 (темные) и шариками MESF от Bangs labs.

Мы использовали шарики с известной способностью связывания антител (Bang’s lab Simply Cellular beads) для измерения абсолютного количества CAR в каждой клеточной линии. Мы также измерили уровни TCR у юркатов дикого типа для сравнения. Мы обнаружили, что на поверхности наших клеточных линий находится от 62 до 238 x10 ³ молекул CAR, по сравнению с 273-547 x10 ³ молекул TCR на Jurkats дикого типа.Количественная оценка и меры контроля подробно представлены на Рисунке 1 — добавлении к рисунку 4.

б) Плотность домена Lov2 в SLB в молекулах / мкм2 во всем диапазоне, который они используют. Это можно сделать с помощью FCS со строчным сканированием (разбавленная флуоресцентная версия с нефлуоресцентной версией, если плотность слишком высока). См. PMID: 19254560.

Вместо FCS с линейным сканированием мы использовали TIRF-микроскопию одиночных молекул для измерения абсолютной плотности LOV2 на бислое. Флуоресцентный LOV2 разбавляли нефлуоресцентным LOV2 и добавляли к бислою до насыщающих концентраций.Подсчитывая одиночные молекулы, мы рассчитали общую LOV2-связывающую способность бислоя при насыщении. Затем мы измерили, какая доля насыщения была достигнута в наших экспериментальных условиях, и использовали это значение для расчета абсолютной концентрации LOV2 на бислоях в наших экспериментах.

Мы обнаружили, что в используемом нами диапазоне концентраций LOV2 содержится от 40 до 1200 молекул / мкм ² . Это находится в том же диапазоне, что и другие, описанные с помощью CAR на плоских липидных бислоях (между 0.1-800 молекул / мкм ² ; Тейлор и др., 2017).

c) Оценка занятости будет неточной, если они не будут включать контроль для исключения несвязывающего мутанта Luv2 или белка аналогичного размера в бислое с разным флуорофором. См .: PMID: 17911103.

Это правда, что исключение несвязанного LOV2 из синапса может повлиять на наши измерения занятости рецепторов. Чтобы оценить, как это может повлиять на наши результаты, мы пересчитали наши результаты по худшему сценарию: все несвязанные молекулы LOV2 исключены из синапса. Мы обнаружили, что это только увеличило величину наблюдаемой кинетической корректуры со значения n 2,7 до 7,0. Таким образом, мы полагаем, что даем консервативную оценку степени корректуры.

3) Было бы полезно увидеть, по крайней мере, ограниченные дифракцией изображения с большим увеличением различных сигналов, чтобы установить корреляцию между контактом IRM, занятостью CAR, ZAP-70 и датчиком домена C2. Это CAR формирует микрокластеры или формирует более крупные домены, как это видно на предоставленных увеличенных изображениях.

Мы включили изображения с большим увеличением занятости CAR, локализации репортера и контакта IRM как для биосенсоров ZAP70, так и для DAG (рисунок 1 — приложение к рисунку 3). Как и ожидалось, ZAP70 демонстрирует четкую совместную локализацию с сайтами занятости рецепторов. DAG имеет диффузную локализацию по всему синапсу. И сайты занятости рецепторов, и репортерной активности содержатся в следе IRM. CAR действительно образует более крупные домены при связывании с LOV2. Однако мы не можем исключить, что отдельные молекулы CAR также заняты и передают сигнал, поскольку свободный от фона LOV2 предотвращает визуализацию отдельных молекул.

4) Необходимо процитировать ряд соответствующих статей, которые имеют отношение к делу, и настоящие результаты, относящиеся к этим исследованиям. Небольшая выборка отсутствующей литературы:

В целом, эти документы превосходны и помогут нам более полно обсудить контекст нашей работы. Ниже мы кратко опишем, как мы обсуждали каждую из предложенных работ, и укажем их расположение в исправленном тексте.

a) Работа лаборатории Дэвиса несколько лет назад по использованию клеточных pMHC, чувствительных к свету, что позволило проводить измерения, описывающие скорость, с которой сигналы распространяются вниз по потоку.

Скорость начала производства DAG в нашей системе сопоставима с ~ 8-секундным «временем смещения», описанным в этой работе. Хотя мы оба используем оптические методы стимуляции, мы не можем напрямую измерить такое «время смещения», потому что синий свет резко прекращает передачу сигналов в нашей системе. После удаления синего света LOV2 медленно возвращается в активное состояние с периодом полураспада ~ 30 секунд. То, что уровни DAG достигают своего максимума в этой шкале времени, предполагает, что после связывания CAR DAG может быть создан в течение нескольких секунд.(Подраздел «Связывание LOV2 индуцирует клеточную сигнализацию»).

b) Роль повторного связывания, которая позволяет лигандам с коротким периодом полураспада передавать сигнал, описана в работе восьми лет назад Ван дер Мерве с соавторами (Immunity) и Хусеби с соавторами.

Эта работа важна, потому что она показывает, что достаточно быстрые скорости могут эффективно занимать рецепторы дольше, чем их период полураспада. Это не только подчеркивает важность, которую другая кинетика связывания может играть в распознавании лигандов, но также позволяет нам указать, что наблюдаемый нами переход в 4-7 секунд между стимулирующим и нестимулирующим периодами полураспада на самом деле может быть заниженным. Время иммобилизации, которое испытывает CAR, может быть больше, если повторное связывание LOV2 происходит достаточно быстро. (Подраздел «Связывание LOV2 индуцирует клеточную сигнализацию»).

c) Роль корецепторов, количество активного Lck и диффузия в кинетическом доказательстве считывания, описанная Stepanek et al., (2014).

Эта работа стала отличным аргументом в пользу сравнения наших результатов, учитывая, что мы не наблюдаем кинетических эффектов корректуры на уровне набора ZAP70. Мы использовали его, чтобы напомнить читателям, что наша система не задействует корецепторы и поэтому может не замечать дополнительных этапов кинетической корректуры в эндогенном TCR.(Раздел обсуждения).

d) Вы также игнорируете данные, представленные лабораторией Germain и другими, которые показывают, что одни и те же сигналы ab TCR по-разному в тимоцитах DP по сравнению со зрелыми клетками [в частности, позволяют значимое распространение сигналов для экспрессии генов в DP с лигандами pMHC, неспособными выбора такого же ответа или биохимических изменений в зрелой Т-клетке], что означает, что внутриклеточные события могут контролировать распространение сигнала отдельно от занятости, периода полужизни или механочувствительности.

Поскольку наша система специально манипулирует периодом полужизни связывания лиганда, мы старались сосредоточить свое внимание на том, как период полужизни связывания влияет на активацию Т-клеток. Эта работа напомнила нам о необходимости подчеркнуть, что реакция Т-клеток не полностью определяется свойствами лиганда, но также чувствительна к внутреннему состоянию Т-клетки. (Подраздел «Количественная оценка степени кинетической корректуры»).

5) Модель вычитки немного странная. Многие люди создали модели, которые намного более реалистичны и включают отзывы, в том числе несколько работ лаборатории Жермена (1995; 1997; 2005; 2002), Чакраборти и Палмера, Чакраборти и Вайсса, а также более теоретические работы Муругана, Хьюза и Лейблер.Эти статьи следует хотя бы процитировать и кратко обсудить.

Мы решили использовать простую модель кинетической корректуры, чтобы уменьшить количество свободных параметров и дать консервативную оценку степени корректуры. Однако, как уже отмечалось, компромисс заключается в том, что модель не имеет прямой аналогии с многочисленными биохимическими стадиями, которые, как было показано другими, важны для распознавания лигандов. Таким образом, наша модель отличается от данных в некоторых важных отношениях, в первую очередь тем, что наши данные показывают, что клетки менее чувствительны к занятости рецепторов, чем прогнозирует модель.Теперь мы подробно обсудим эти ограничения нашей модели и то, как ее можно улучшить путем включения аспектов ранее опубликованных моделей. (Подраздел «Количественная оценка степени кинетической корректуры») и в других местах статьи.

6) Оценка в 3 шага корректуры несомненно неверна. Различные шаги не имеют одинаковых временных масштабов, и есть петли обратной связи. Эти эффекты затрудняют интерпретацию модели для получения n. Эту часть нужно удалить.

Мы согласны с тем, что три этапа корректуры, вероятно, являются чрезмерным упрощением и могут сбить с толку некоторых читателей. Соответствующий раздел удален.

7) Комментарии о том, что ZAP70 не подлежит кинетической проверке во Введении, необходимо делать с большой осторожностью. Два момента, на которые следует обратить внимание в этом отношении: а] Есть данные, предполагающие, что частичное фосфорилирование ITAM, по крайней мере, коррелирует, если не связано с антагонизмом. b] in vivo ZAP, который связывается с TCR, не фосфорилируется.Также обратите внимание, что in vivo Т-клетки постоянно стимулируются собственными лигандами (см. Недавнюю статью Weiss, Chakraborty и др. В MCB).

Мы думаем, что автор обзора поднимает важный вопрос о том, что эквивалентные количества рекрутирования ZAP70 не обязательно означают эквивалентные количества фосфорилирования рецептора или активации ZAP70. В данной рукописи мы более осторожны, чтобы ограничить наши утверждения нашими прямыми экспериментальными измерениями — кинетическая корректура не наблюдается на уровне набора ZAP70, но наблюдается на уровне накопления DAG.

[Примечание редакции: до принятия были запрошены дополнительные исправления, как описано ниже.]

Рецензирующий редактор попросил вас рассмотреть один вопрос до принятия окончательного решения. Опишите шаги по оптимизации адгезионной системы и конкретные требования к выбранной системе. Кроме того, следует обсудить значение этой адгезионной системы для кинетической корректуры — также известной как модель кинетической сегрегации. Например, может ли отсутствие кинетической корректуры в проксимальной передаче сигналов TCR быть следствием присутствия системы адгезии, которая заботится об исключении CD45 и делает передачу сигналов вопросом занятости? Если бы светозависимая кинетика контролировала сегрегацию CD45, проявил бы этот шаг чувствительность к кинетике?

Последние соответствующие документы включают:

Chang et al., 2016.

Cai et al., 2018.

Редактор не требует дополнительных экспериментов, а просто прозрачного обсуждения результатов системы адгезии, почему анти-β2m, и действительно ли это требуется для передачи сигналов с помощью инактивированного светом CAR.

Рецензент № 1:

Исследование продолжает бороться с доказательством «кинетической корректуры» (KP) из-за того, что зависящее от света ускорение диссоциации домена LOV2 от Zdk1 не влияет на скорость темновой реверсии (по скорости), поэтому сродство уменьшается на синий свет.Это аналогичное ограничение, с которым сталкиваются люди, работающие с системами на основе мутаций для TCR или CAR. Уравнение действия массы очень затрудняет изменение периода полураспада при сохранении постоянного сродства и занятости. Они частично компенсируют это, проводя эксперименты с различной плотностью домена LOV2, чтобы обеспечить согласованную занятость рецепторов при любой интенсивности света. Эти плотности сейчас указаны, но есть сюрприз. Отчасти это удается, поскольку они видят лучшую корреляцию DAG с кинетикой, а не с занятостью, но ожидается, что эта система полностью сработает при низкой загруженности, поэтому ожидается отсутствие линейной зависимости от занятости.Таким образом, на практике доказательство КП не так широко развито, но потенциал есть. Для его полного использования необходимы дополнительные инновации.

Существенные изменения:

Авторы добавили синтетическую адгезионную систему, которая упоминалась только в методах и некоторых легендах. Они используют биотинилированное mAb к β2m, которое должно притягивать клетки очень близко к субстрату, возможно, менее чем на 10 нм. Я предполагаю, что это исключит CD45, по крайней мере, частично, если не совсем надежно (авторы должны это проверить), поэтому все, что им нужно сделать для запуска CAR, — это втянуть их в эти тесные контакты.Это меняет все, поскольку они не заставляют взаимодействие LOV2-Zdk1 достигать КП посредством «кинетической сегрегации». Многие считают, что это критический процесс, который должен опосредоваться рецептором, несущим ITAM, чтобы инициировать передачу сигналов во многих контекстах. Таким образом, эта система адгезии и ее последствия должны быть описаны в плане эксперимента и схемах на рисунках, поскольку она, вероятно, имеет решающее значение для интерпретации. Может ли система вообще работать без этой синтетической адгезионной системы? Это может объяснить, почему они не видят кинетической корректуры на уровне ZAP-70, так как его набор выполняется системой адгезии, а затем вводится CAR в тесные контакты.

Другой сюрприз заключается в том, что связывание домена LOV2 демонстрирует значительную положительную кооперативность при связывании с SLB, что позволяет предположить, что он олигомеризуется. Как это влияет на измерения и интерпретацию?

Первоначально мы включили систему пассивной адгезии, чтобы гарантировать, что уменьшение сигнала TIRF не может быть связано с отсоединением клеток от бислоя. В конечном счете, эта система является незаменимой, поскольку эксперименты, включенные в приложение (рисунок 4 — рисунок в приложении 3) без адгезионной системы, показывают эквивалентную степень кинетической корректуры ( n в нашей модели) на уровне DAG.Таким образом, система пассивной адгезии не использовалась для данных ZAP70 и не могла повлиять на эти результаты. Однако мы отмечаем, что кинетическая сегрегация CD45 может по-разному влиять на кинетическую корректуру в контексте нативного TCR-pMHC, где размер extodomains может отличаться от нашей пары CAR-LOV2. Исправления для отражения этих изменений в разделе «Обсуждение». Кроме того, мы добавили еще две ссылки на недавние статьи, в которых подчеркивается кинетическая корректура за пределами TCR как примеры областей, в которых наш подход может быть полезен в будущем.

[Примечание редакции: до принятия были запрошены дополнительные исправления, как описано ниже.]

Благодарим вас за отправку вашей статьи «Настройка периода полужизни лиганда на основе света поддерживает кинетическую корректирующую модель передачи сигналов Т-клеток» на рассмотрение eLife. Ваша исправленная статья и ответ на наш запрос были рассмотрены рецензентом редактора и Арупом Чакраборти в качестве главного редактора.

К сожалению, ваш ответ не касается единственной проблемы, которую необходимо решить. Когда впервые возник вопрос о адгезии, мы спросили о взаимодействии с низким сродством в выключенном состоянии, которое может поддерживать остаточную адгезию. Вы отметили, что это не актуальный вопрос, потому что система адгезии была добавлена, чтобы сделать систему независимой от взаимодействий CAR с лигандом, чтобы клетки оставались на месте в течение многих циклов. Теперь вы говорите, что система склеивания не нужна, и на самом деле вы не использовали ее для исследований, посвященных роли ZAP-70 в кинетической корректуре. Учитывая это, к сожалению, мы должны спросить еще раз, указывает ли это на то, что существует взаимодействие с низким сродством в 100% «выключенном» состоянии, которое могло бы опосредовать некоторую остаточную адгезию, но без передачи сигналов.Если клетки остаются прикрепленными в присутствии самого интенсивного синего света, который полностью отключит взаимодействие, то, похоже, наличие такого взаимодействия будет подтверждено. Можете ли вы признать это, или у вас есть другое объяснение системы, работающей с параллельной системой склеивания или без нее?

Для экспериментов ZAP70, где пассивная адгезия не использовалась, мы согласны с составителем обзора, что остаточная адгезия могла быть из-за многих слабых взаимодействий с LOV2 в состоянии с низким сродством. Альтернативная возможность состоит в том, что, поскольку насыщающие количества синего света (как было определено в наших экспериментах по связыванию LOV2-Zdk in vitro) не были необходимы для максимального подавления клеточной передачи сигналов, клетки никогда не подвергались насыщающему количеству синего света, что означает небольшую долю LOV2, вероятно, все еще существовал в конформации с высоким сродством. Эта небольшая популяция LOV2 может также объяснить остаточную адгезию, которую мы наблюдали. Обе эти возможности теперь обсуждаются, чтобы дать более полное техническое описание новой системы.

https://doi.org/10.7554/eLife.42498.032

Точная настройка уровней экспрессии генов в клетках млекопитающих

Создание библиотеки вариантов MRE

Последовательности всех олигонуклеотидов, использованных в этом исследовании, перечислены в дополнительном наборе данных 1. Мы приобрели смешанные вручную частично вырожденные олигонуклеотиды у компании Integrated DNA Technologies (IDT) содержащий константную фланкирующую область и вариабельную область с частичной комплементарностью либо hsa-miR-17, либо hsa-miR-21. В этом исследовании термин синтетический MRE относится к последовательности равной длины, в значительной степени комплементарной данной miRNA. В этой библиотеке имеется 69 возможных вариантов с одним нуклеотидом для последовательности 23nt (в каждом положении есть три возможных способа ввести несовпадение). Для последовательности длиной n количество комбинаций с r несовпадениями определяется по формуле:

$$ C \ left ({n, r} \ right) = \ frac {{n!}} {{\ Left ({r! \ left ({n — r} \ right)!} \ right)}} $$

(1)

Следовательно, для 23nt последовательности существует 253 комбинации динуклеотидных несовпадений.Каждую базу можно изменить 3 способами, что дает 2277 комбинаций несовпадений (253 × 3 × 3). Для достижения максимального охвата вариантов с одним и двумя нуклеотидами 91% комплементарного основания и 3% каждого некомплементарного основания были включены в каждое положение в библиотеках MRE. Каждый вырожденный олигонуклеотид амплифицировали в трех повторностях с использованием основной смеси Phusion High-Fidelity PCR Master Mix с буфером GC (NEB), используя праймеры miR17_Lib_Gen_F и miR17_Lib_Gen_R, которые присоединяют сайты узнавания BsmBI с обеих сторон MRE. Полученные продукты ПЦР объединяли и очищали с использованием набора для очистки MinElute PCR Purification Kit (Qiagen).

Мы провели широкомасштабную реакцию рестрикционного клонирования для лигирования вырожденного продукта ПЦР MRE в репортерную плазмиду. Репортерная плазмида содержит двунаправленный промотор CMV, управляющий экспрессией iBlue, слитый с сигналом деградации, полученным из орнитиндекарбоксилазы, и ECFP, слитым с одним и тем же сигналом деградации. Мы линеаризовали 10,5 мкг репортерной плазмиды ниже ECFP путем переваривания BsmBI.

Вырожденный продукт ПЦР MRE (300 нг) разрезали BsmBI и лигировали с линеаризованной, дефосфорилированной (антарктическая фосфатаза, NEB) и очищенной в геле (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen) репортерной плазмидой с использованием ДНК-лигазы Т4 (NEB) при 16 ° C в течение ночи. Мы очистили лигирование с помощью набора для очистки QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и трансформировали приблизительно 3,6 мкг очищенного продукта в 10-бета-электрокомпетентную кишечную палочку (NEB), следуя инструкциям производителя. Трансформанты высевали в течение ночи при 32 ° C на 24 часа.5 см ² чашек с LB агаром, обработанным ампициллином. Мы восстановили полученную библиотеку плазмид с помощью набора QIAfilter Plasmid Midi Kit (Qiagen).

Трансфекция культуры клеток HEK-293T и библиотеки вариантов MRE

Клетки HEK-293T (приобретенные в ATCC, ATCC-CRL-11268) выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Gibco) с добавлением 15% FBS (GIBCO) и 1% пенициллин-стрептомицин (P / S, 10 000 Ед / мл, Gibco). В начале проекта мы проверили клетки на наличие микоплазмы. Клетки высевали в 12-луночные планшеты за 24 ч до трансфекции, что позволяло им достичь 80-90% конфлюэнтности в день трансфекции.В день трансфекции мы заменили полную среду для роста на DMEM, 2% FBS (без P / S). Мы приготовили три независимых смеси для трансфекции, каждая из которых содержала 4 мкг вырожденной репортерной библиотеки MRE, 4 нг контрольной плазмиды miR-Cel-67 MRE и 12 мкл полиэтиленимина (PEI, 1 мг / мл, Sigma-Aldrich) в 400 мкл Opti- МЕМ (Гибко). Каждую смесь наносили по каплям в 4 лунки 12-луночного планшета и инкубировали в течение 24 часов.

Профилирование полисом

Чтобы получить достаточное количество клеточного лизата для профилирования полисом, мы высевали клетки HEK-293T в две независимые 15 см чашки для культивирования ² , что позволило им достичь слияния 70–80% к дню трансфекции.Для каждой чашки мы объединили 25 мкл каждого реагента Lipofectamine 3000 и P3000 (Thermo Fisher) с 12,5 мкг вырожденной репортерной библиотеки MRE и 100 нг контрольной плазмиды miR-Cel-67 MRE, трансфицировали в соответствии с инструкциями производителя и инкубировали в течение 24 дней. час Чтобы остановить трансляцию, в чашки для культивирования добавляли циклогексимид (CHX, Merck) в концентрации 100 мкг / мл в течение 10 мин при 37 ° C. Затем чашки помещали на лед и промывали холодным PBS (Life Technologies) с добавлением CHX (100 мкг / мл). Мы соскребали чашки в PBS + CHX (100 мкг / мл), центрифугировали собранные клетки при 1000 × г в течение 3 минут при 4 ° C и отбрасывали супернатант. Осадки клеток ресуспендировали в 200 мкл буфера для гипотонического лизиса (10 мМ HEPES pH 7,8, 1,5 мМ MgCl ₂ , 10 мМ KCl, 0,5 мМ DTT, 1% Triton X-100 и 100 мг / мл CHX) и инкубировали. на льду 5 мин. Затем мы лизировали клетки с помощью 10 ударов через иглу 26 размера и осаждали ядра центрифугированием при 1500 × g в течение 5 минут при 4 ° C. Супернатант мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C.

Градиенты сахарозы 10–50% (мас. / Об.) Были получены с использованием Gradient Master (Biocomp Instruments) из 10% и 50% растворов сахарозы в градиентном буфере (100 мМ KCl, 5 мМ MgCl. ₂ , 20 мМ HEPES- КОН pH7.5, 1 мМ DTT, 100 мкг / мл CHX). Мы разморозили клеточные лизаты и наслоили их поверх градиентов охлажденной сахарозы перед центрифугированием при 4 ° C в течение 2 часов при 36000 об / мин (160 030 × г, среднее значение ) в роторе SW-41. Градиенты фракционировали сверху, используя Gradient Fractionator (Biocomp Instruments). Для выделения РНК из полученных фракций мы добавили 2,25 объема 8 М гуанидин HCl (Sigma-Aldrich) и встряхнули образцы. Затем добавляли 3,25 объема изопропанола, и образцы инкубировали в течение ночи при -20 ° C.Реакционные смеси центрифугировали при> 13000 × g в течение 30 минут при 4 ° C и супернатант аспирировали. Осадки РНК ресуспендировали в смеси из 90 мкл свободной от нуклеаз H ₂ O (Invitrogen), 10 мкл 3 M ацетата натрия (Invitrogen) и 1 мкл 5 мг / мл гликогена (Ambion) и осаждали 250 мкл холода. 100% этанол (VWR). После 30 мин инкубации на льду образцы центрифугировали при> 13000 × g в течение 30 мин при 4 ° C. Затем осадки промывали 500 мкл 70% этанола и ресуспендировали в свободной от нуклеаз H ₂ O.

Подготовка библиотеки пДНК и кДНК и высокопроизводительное секвенирование

Мы использовали мини-набор All Prep DNA / RNA Mini (Qiagen) для одновременного извлечения плазмидной ДНК (пДНК) и мРНК из клеток HEK-293T, трансфицированных вырожденной репортерной библиотекой MRE. После выполнения очистки геномной ДНК кДНК была получена из мРНК и полисомно-связанной РНК с использованием набора для обратной транскрипции QuantiTect (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Чтобы создать библиотеки ампликонов для высокопроизводительного секвенирования, вырожденный MRE и короткую фланкирующую область амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров bi-dir-Miseq-F и bi-dir-Miseq-R.Для кДНК и пДНК мы использовали смесь Phusion High-Fidelity PCR Master Mix с буфером для GC (NEB) и следующие условия цикла: начальная денатурация (98 ° C в течение 30 с), 23 цикла амплификации (98 ° C в течение 10 с, 65 ° C в течение 10 с, 72 ° C в течение 10 с) и окончательное удлинение (72 ° C в течение 5 мин). Мы использовали 20 нг пДНК и кДНК, полученные из 200 нг РНК, в качестве входных данных для этих ПЦР. Для кДНК из РНК, выделенной из полисомных фракций, мы использовали KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Fisher Scientific) и следующие условия цикла: начальная денатурация (98 ° C в течение 30 с), 21 цикл амплификации (98 ° C в течение 10 секунд, 65 ° C для 10 с, 72 ° C в течение 10 с) и окончательное удлинение (72 ° C в течение 5 минут). кДНК из 100 нг ассоциированной с полисомами РНК использовали в качестве входных данных для каждой ПЦР. Эти исходные продукты ПЦР очищали в геле с использованием набора для экстракции гелей QIAquick (Qiagen). Мы разбавили восстановленный продукт от 10 до 30 раз в зависимости от интенсивности полосы.

Чтобы сделать библиотеки ампликонов совместимыми с машинами Illumina, мы выполнили вторую ПЦР, чтобы добавить последовательности индекса TruSeq и адаптеры p5 / p7 к каждому ампликону. Мы использовали стратегию двойного штрих-кодирования, при которой каждому биологическому образцу присваивалась уникальная комбинация праймеров прямого и обратного индекса.Мы провели ПЦР с Master Mix Phusion High-Fidelity PCR Master Mix с буфером для ГХ (NEB) и в следующих условиях цикла: начальная денатурация (98 ° C в течение 30 с), 13 циклов амплификации (98 ° C в течение 10 секунд, 62 ° C для 10 с, 72 ° C в течение 10 с) и окончательное удлинение (72 ° C в течение 5 минут).

Производитель сообщает о частоте ошибок 9,5 × 10 ⁻⁷ для основной смеси Phusion High-Fidelity PCR Master Mix в буфере для ГХ. После 36 полных циклов ПЦР мы ожидаем совокупную частоту ошибок <3,6 × 10 ^-5 .Этот коэффициент ошибок никак не повлияет на наши оценки эффективности MRE. Важно отметить, что высокая воспроизводимость между репликами библиотеки и сильная корреляция между данными HTS и валидационными экспериментами RT-qPCR подтверждают мнение о том, что наши результаты не связаны с ошибкой ПЦР или смещением амплификации.

Мы использовали гранулы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) при 0,75 × для очистки библиотек ампликонов, которые мы впоследствии количественно оценили с помощью набора Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher Scientific).Образцы секвенировали (секвенирование 150 п.н. PE) либо на HiSeq4000 (Illumina), либо на MiSeq v2 (Illumina).

Анализ данных высокопроизводительного секвенирования

Данные высокопроизводительного секвенирования были проанализированы с использованием R (версия 3.4.1), и все сценарии доступны по запросу. После проверки качества данных секвенирования с помощью FastQC мы использовали пакет Biostrings (версия 2. 44.2) для обрезки показаний до MRE и последующего подсчета появления каждого типа интересующего варианта во всех библиотеках ампликонов.Было восстановлено не менее 6000 считываний для всех 69 возможных однонуклеотидных вариантов в каждой библиотеке пДНК. Было восстановлено по меньшей мере 100 считываний для всех 2277 возможных динуклеотидных вариантов MRE в каждой библиотеке пДНК (среднее значение = 315,56, стандартное отклонение = 85,74). Мы рассчитали частоту вариантов, нормализовав счетчики чтения каждого интересующего варианта к общему счету чтения библиотеки в соответствующей библиотеке. Мы рассчитали количество транскриптов для каждого варианта, разделив его частоту считывания в библиотеке кДНК на частоту считывания в соответствующей библиотеке пДНК.Мы рассчитали эффективность трансляции для вариантов, присутствующих в профилях полисом, разделив их частоту считывания в библиотеке, связанной с тяжелыми полисомами, на частоту считывания в соответствующей библиотеке, связанной с моносомами.

Проверка результатов высокопроизводительного секвенирования с помощью RT-qPCR

Для проверки нашего высокопроизводительного анализа секвенирования мы случайным образом выбрали варианты miR-17-MRE путем скрининга колоний из разведения библиотеки вариантов 1/30 000 путем секвенирования по Сэнгеру с использованием праймера. bi-dir-MRE-seq-1.Колонии подвергали скринингу, пока не идентифицировали 15 уникальных вариантов с одним и двумя нуклеотидами. Случайно выбранные варианты отражают объективное представление всей библиотеки вариантов. Следует отметить, что среднее число считываний в библиотеках пДНК для вариантов с двойным нуклеотидом в этом наборе случайной проверки составляет 323,87 (SD = 81,8), что согласуется со средним числом считываний для всех возможных двойных нуклеотидов.

Эти конструкции были индивидуально трансфицированы в клетки HEK-293-T в трех повторностях в дополнение к контрольным репортерам, кодирующим Cel-miR-67-MRE и совершенно комплементарный miR-17 MRE, с использованием метода трансфекции PEI, описанного выше. Через 24 часа после трансфекции мы экстрагировали РНК с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Для каждой реплики кДНК генерировали из 100 нг общей РНК с использованием набора для обратной транскрипции QuantiTect (Qiagen). Мы провели RT-qPCR с использованием набора SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) на системе реального времени CFX384 (Bio-Rad) с парами праймеров, охватывающими MRE (MRE_qPCR-F и MRE_qPCR-F) или в транскрипте iBlue. (iBlue_qPCR-F и iBlue_qPCR-F), который служит внутренним контролем. Метод ΔΔCt использовали для сравнения экспрессии всех вариантов MRE с контрольным репортером Cel-67-MRE путем сравнения Ct ECFP с таковой iBlue для каждой реплики образца.

Клонирование лентивирусного вектора и производство вируса

Мы создали лентивирусные экспрессионные векторы EGFP, PD-1 и PD-L1, используя стандартные методы рестрикционного клонирования. Исходный вектор AB.pCCL.sin.cPPT.GFP.miR-17-3p.sensor.PGK.dNGFR.WPRE был подарком от Брайана Брауна (плазмида Addgene № 85866). Чтобы упростить последующие шаги клонирования, сайт узнавания SbfI был введен после минимального промотора CMV. ORF для PD-1 и PD-L1 человека были амплифицированы из векторов BRET PD-1 и PD-L1 соответственно (щедрый подарок от Саймона Дэвиса) с использованием праймеров PD1_Lenti_Shuttle_F / PD-L1_Lenti_Shuttle_F и PDL1_Lenti_Shuttle_R.Мы переваривали эти продукты ПЦР, а также целевой вектор с помощью SbfI и NheI и лигировали их с использованием ДНК-лигазы Т4 (NEB).

Система In-Fusion HD Cloning System (Takara Clontech) использовалась для замены PD-1 в лентивирусном экспрессирующем векторе на локализованный в цитоплазме овальбумин (OVA), связанный с EGFP сигналом расщепления пептида T2A для создания OVA-T2A-EGFP вектор. Мы с помощью ПЦР амплифицировали T2A-EGFP из pX458 (подарок от Feng Zhang, плазмида Addgene № 48138) с праймерами GFP_in_fusion_F2 и EGFP-in-fusion-R.OVA (без первых 47 аминокислот) амплифицировали из вектора OVACyt ⁴⁰ с использованием праймеров Ova_In_Fusion_R2 и Ova-in-fusion-F. Мы слили родительский вектор (линеаризованный с помощью SbfI и NheI) с двумя вставками, следуя инструкциям производителя In-Fusion. Для создания векторов настройки miSFIT мы создали вставки MRE из коротких олигонуклеотидов (IDT). Вставки MRE были отожжены и фосфорилированы (T4 PNK, NEB) и введены ниже PD1 или OVA-T2A-EGFP путем рестрикционного клонирования между NheI и AgeI.Встраивание MRE было подтверждено секвенированием по Сэнгеру с использованием праймера BBBdir-seq-2.

Для получения лентивирусных частиц в клетках HEK-293T мы котрансфицировали каждый вектор переноса лентивируса с помощью pCMV-dR8.91 и pMD2.G в соотношении 1,5: 1: 1 с использованием полиэтиленимина (PEI, 1 мг / мл, Sigma -Aldrich), как описано выше. Через 24 часа мы заменили среду для трансфекции (DMEM, 2% FBS, без P / S) на полную среду (DMEM, 15% FBS). Мы собрали и профильтровали (фильтр 0,22 мкм, Millipore) вирусный супернатант через 24 часа и хранили его при -80 ° C до трансдукции.Мы трансдуцировали клетки B16-F10 и Т-клетки Jurkat, используя неконцентрированный вирусный супернатант. Т-клетки Jurkat (клон 1.G4, подарок от Саймона Дэвиса) поддерживали в среде RPMI-1640 (Gibco) с добавлением 10 мМ HEPES (Life Technologies), 1 мМ пирувата натрия (Life Technologies) и 15% фетального коровьего молока. Сыворотка (FBS, GIBCO). Клетки меланомы B16-F10 (ATCC-CRL-6475) выращивали в среде DMEM (Gibco) с добавлением 15% FBS (Gibco). Клетки Jurkat и B16-F10 были проверены на микоплазму в начале проекта.

Проточная цитометрия и сортировка клеток с активацией флуоресценции

Все эксперименты проточной цитометрии проводились на анализаторе BD LSR Fortessa Analyzer или FACSymphony (BD Biosciences), а данные анализировались с помощью FlowJo (версия 10.3.0). Мы собирали прилипшие клетки (B16-F10 или HEK 293T) с использованием 0,05% трипсина с ЭДТА (Thermo Fisher Scientific). Для экспериментов, требующих окрашивания антител, мы промывали клетки буфером FACS (PBS с 5% FBS) до и после окрашивания. Для обзора наших стратегий стробирования проточной цитометрии см. Дополнительные рисунки. Для создания клеточных линий miSFIT мы трансдуцировали клетки с низкой множественностью инфицирования (для Т-клеток Jurkat трансдуцированных <15%, для B16-F10s <3% трансдуцированных), выжидали 5-7 дней и отбирали стабильно трансдуцированные клетки с помощью FACS с использованием клетки SH800S. Сортировщик (SONY) с сортировочным чипом 100 мкм. Мы отсортировали пулы примерно из 150 000 клеток на линию на основе экспрессии NGFR.

Совместное культивирование меланомы B16-F10 / Т-клеток

Чтобы изучить, как уровни антигена влияют на активацию Т-клеток и приспособленность клеток in vitro, мы совместно культивировали наши клеточные линии B16-F10 OVA-miSFIT с Т-клетками OT-I .Первичные спленоциты собирали у мышей C57BL / 6, OT-I и стимулировали пептидом SIINFEKL (20 мкг / мл кембриджских пептидов) и IL-2 (10 единиц / мл BioLegend) в RPMI-1640 (Gibco) с добавлением 10% FBS ( Gibco), 1% P / S, (10,000 Ед / мл, Gibco), 10 мМ HEPES (Life Technologies), 1 мМ пируват натрия (Life Technologies), 50 мкМ 2-меркаптоэтанол (Gibco) и 1% MEM, несущественные Аминокислоты (Gibco). Через 48 ч Т-клетки CD8 ⁺ выделяли с использованием набора для выделения Т-клеток CD8a ⁺ мыши (Miltenyi Biotec).Для экспериментов по приспособленности к меланоме 20000 клеток B16-F10 (смесь примерно 50/50 OVA-клеток B16-F10 и клеток OVA ⁺ , miSFIT) высевали на лунку в 96-луночный планшет ( n = 3 на лунку). клеточная линия). После того, как клетки B16-F10 прикрепились в течение 3 часов, Т-клетки OT-I были добавлены в каждую лунку при различных соотношениях Т-клетки: B16-F10. Смешанные культуры инкубировали в течение ночи и анализировали проточной цитометрией. Относительную приспособленность рассчитывали путем деления частоты клеток NGFR ⁺ в состоянии + Т-клеток на частоту клеток NGFR ⁺ в состоянии отсутствия Т-клеток.Для экспериментов по активации Т-клеток стимулированные Т-клетки выдерживали в течение 72 часов перед совместным культивированием с отдельными линиями клеток OVA-miSFIT при соотношении Т-клеток к B16-F10 8: 1 ( n = 5 на клетку линия). Через 24 часа мы проанализировали Т-клетки методом проточной цитометрии. Клоны антител и их поставщики перечислены в дополнительной таблице 1.

Анализы роста опухоли in vivo

Для анализов роста опухолей in vivo 150000 клеток B16-F10 OVA-miSFIT внутрикожно вводили мышам-реципиентам WT C57BL / 6 ( n = 6 мышей-реципиентов на клеточную линию) в день 0.Мы изолировали Т-клетки ОТ-I и стимулировали их в течение 48 часов (см. Выше и рис. 4а) и внутривенно вводили 500 000 CD8 ⁺ , Т-клеток ОТ-1 на мышь-реципиент на 7 день. После инфузии Т-клеток. мы измеряли опухоли через день с помощью цифровых штангенциркулей (Fisher Scientific). Экспериментатор, проводивший измерения, не знал, что это за опухоль. Мы отобрали мышей с размером опухоли более 95 мм ² , используя утвержденные методы. Мышей, у которых не было обнаруживаемых опухолей к 17 дню, исключали из исследования.

Для анализа TIL опухоли вводили, как описано выше, но Т-клетки OT-I были адоптивно перенесены на 8-й день, чтобы снизить вероятность полного исчезновения опухоли. На 13 день всех мышей отбирали, а селезенки и опухоли собирали путем вскрытия. Селезенки обрабатывали, как описано выше, и опухоли диссоциировали с использованием набора для диссоциации опухолей, мышь (Miltenyi Biotec). Клетки промывали, блокировали TruStain fcX (Biolegend) и окрашивали антителами, как указано в дополнительной таблице 1.Эксперименты на животных проводились в соответствии с лицензией на проект, одобренной внутренним наблюдательным советом Оксфорда и головным офисом Великобритании, и проводились в соответствии с соответствующими правилами тестирования и исследований на животных.

CRISPR / Cas9, опосредованная настройка эндогенного BRCA1

sgRNA, нацеленная на спейсерную последовательность 5′-AAGAGTGAGAGGAGCTCCCA-3 ‘в 3’UTR BRCA1, была клонирована в вектор экспрессии pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458, подарок от Feng Zhang, плазмида Addgene № 48138). Доноры ssODN HDR, разработанные для содержания каждого варианта miSFIT и сайта узнавания NheI, фланкированного с обеих сторон плечами гомологии 45nt, были синтезированы с помощью технологий Integrated DNA. Доноры HDR были разработаны для разрушения эндогенного сайта SacI в целевом локусе. Все 18 доноров HDR (15 вариантов miSFIT, 1 × и 2 × полностью комплементарные сайты и скремблированный MRE) повторно суспендировали до 100 мкМ и объединяли. Мы нуклеофицировали 1 × 10 ⁵ клеток HEK-293T с плазмидой экспрессии sgRNA (500 нг) и объединенными донорами HDR (0,2 мкл, 100 мкМ исходный раствор), используя систему трансфекции Neon (ThermoFisher Scientific) в наконечнике 10 мкл (1150 мкл). V, 20 мс, 2 импульса). Мы выполнили 9 нуклеофекций, которые были объединены в группы по три человека для получения трех биологических повторов.

Через 72 часа после нуклеофекции мы одновременно собрали геномную ДНК и мРНК, используя мини-набор All Prep DNA / RNA Mini (Qiagen). Загрязняющую гДНК удаляли из выделенной РНК с помощью набора Turbo DNA-free (ThermoFisher Scientific), а кДНК генерировали с помощью набора для обратной транскрипции QuantiTect (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя.

Для создания библиотек ампликонов для высокопроизводительного секвенирования целевой локус в 3’UTR BRCA1 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров BRCA1-Miseq-F и BRCA1-Miseq-R.Мы использовали смесь Phusion High-Fidelity PCR Master Mix с буфером для ГХ (NEB) и следующие условия цикла: начальная денатурация (98 ° C в течение 30 с), 33 цикла амплификации (98 ° C в течение 10 секунд, 64 ° C в течение 12 секунд, 72 ° C в течение 12 с) и окончательное удлинение (72 ° C в течение 5 минут). Мы использовали 50 нг гДНК и кДНК, полученные из 200 нг РНК, в качестве входных данных для этих ПЦР. ПЦР очищали с использованием набора для очистки MinElute PCR Purification Kit (Qiagen). Для обогащения гДНК / кДНК, отредактированных CRISPR / Cas9, мы расщепили ДНК WT из этих продуктов ПЦР с помощью SacI-HF (NEB) и очистили в геле оставшийся модифицированный CRISPR / Cas9 непереваренный продукт ПЦР (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen) .Адаптеры секвенирования Illumina и уникальные комбинации штрих-кодов были добавлены к HDR-обогащенной ДНК с помощью ПЦР. Мы использовали смесь Phusion High-Fidelity PCR Master Mix с буфером для ГХ (NEB) и следующие условия цикла: начальная денатурация (98 ° C в течение 30 с), 12 циклов амплификации (98 ° C в течение 10 секунд, 62 ° C в течение 10 секунд, 72 ° C в течение 10 с) и окончательное удлинение (72 ° C в течение 5 минут). Мы очистили, количественно оценили и секвенировали полученные библиотеки ампликонов, как описано выше.

Доступность кода

Пользовательские сценарии R, используемые для анализа данных HTS, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне экспериментов доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Настройка Т-лимфоцитов через арилуглеводородный рецептор

Исходя из их соответствующих ролей в иммунной толерантности и воспалении, регуляторные Т (T _Reg ) клетки и интерлейкин-17 (IL-17) -продуцирующие CD4 ⁺ Т-хелперные клетки (T _H 17 клеток) являются областями интенсивное обучение. Два новых сообщения в Nature теперь идентифицировали арилуглеводородный рецептор (AHR) как важный лиганд-зависимый регулятор этих реципрокных популяций Т-клеток.

AHR представляет собой фактор транскрипции, экспрессируемый многими типами клеток, но его физиологическая роль в иммунной системе еще не определена. Лиганды AHR включают токсин окружающей среды TCDD (2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин) и эндогенные молекулы, такие как FICZ (6-формилиндоло [3,2-b] карбазол), продукт, производный от триптофана, который считается образуются в коже после воздействия ультрафиолетового света.Теперь исследования лабораторий Weiner и Stockinger показывают, что запуск AHR стимулирует дифференцировку T _Reg -клетки или T _H 17-клеток лиганд-специфическим образом и, соответственно, может защищать или способствовать развитию EAE ( экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит), мышиную модель рассеянного склероза.

Weiner и его коллеги обнаружили, что TCDD-опосредованная активация AHR напрямую повышает экспрессию Foxp3 , гена, который, как известно, необходим для функции клеток T _Reg , и что клетки T _Reg экспрессируют более высокие уровни AHR, чем другие Т-клетки. Кроме того, TCDD способствовал дифференцировке новых антиген-специфичных клеток T _Reg in vitro и in vivo , что уменьшало тяжесть заболевания в модели индуцированного EAE. Однако обработка мышей эндогенным лигандом AHR FICZ имела противоположный эффект: ингибировалась дифференцировка клеток T _Reg , а вместо этого увеличивалась дифференцировка клеток T _H 17 и тяжесть EAE.

Stockinger и его коллеги также обнаружили, что лечение мышей FICZ усиливает эффекторную функцию дифференцированных клеток T _H 17 и ухудшает тяжесть EAE.Здесь запуск AHR с помощью FICZ заметно увеличивал продукцию IL-17 и IL-22 патогенными клетками T _H 17, но не влиял на индуцированные или встречающиеся в природе популяции клеток T _Reg . Кроме того, не было обнаружено, что клетки T _Reg предпочтительно экспрессируют AHR, как сообщили Weiner и его коллеги. Аналогичные результаты были получены с другим лигандом, β-нафтофлавоном, который, как и TCDD, является токсином окружающей среды, но с более низким сродством к AHR.

Взаимодействие AHR с другими факторами транскрипции, такими как ядерный фактор-κB, может влиять на его молекулярную функцию.Кроме того, известно, что AHR взаимно перекрестно регулирует путь передачи сигнала трансформирующего фактора роста-β (TGFβ). Подобно AHR, передача сигналов TGFβ может индуцировать дифференцировку либо T _H 17-клеток, либо T _Reg -клеток, в зависимости от присутствия других цитокинов в микроокружении. Следовательно, AHR и TGFβ могут быть одинаковыми в их контекстно-зависимом управлении дифференцировкой Т-клеток или могут действовать синергетически в стимулировании либо клеток T _H 17, либо клеток T _Reg , в зависимости от природы иммунного ответа.

Поскольку AHR важен для клеточных реакций на токсины окружающей среды, такие как TCDD, воздействие таких агентов может исказить популяции Т-клеток и повлиять на тонкий баланс между иммунной толерантностью и аутоиммунитетом. Обнаружение того, что некоторые лиганды AHR могут способствовать клеткам T _H 17, открывает возможности для разработки новых методов лечения, направленных на эти клетки in vivo .

Ссылки

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

1. 1

   Quintana, F.J. et al. Контроль дифференцировки клеток Treg и Th27 арилуглеводородным рецептором. Nature 23 марта 2008 г. (DOI: 10.1038 / nature06880)

   CAS
   Статья

   Google ученый

2. 2

   Veldhoen, M. et al. Арилуглеводородный рецептор связывает опосредованный клетками Th27 аутоиммунитет с токсинами окружающей среды. Nature 23 марта 2008 г. (DOI: 10.1038 / nature06881)

   CAS
   Статья

   Google ученый

ДАЛЬНЕЙШИЕ ЧТЕНИЯ

1. org/ScholarlyArticle»> 3

   Донг, К.Клетки Th27 в разработке: обновленное представление об их молекулярной идентичности и генетическом программировании. Nature Rev. Immunol. 8 , 337–348 (2008)

   CAS
   Статья

   Google ученый

Скачать ссылки

Об этой статье

Цитировать эту статью

Allan, S. Настройка Т-клеток через арилуглеводородный рецептор.
Nat Rev Immunol 8, 326 (2008).https://doi.org/10.1038/nri2319

Ссылка для скачивания

Дополнительная литература

• Возникающая роль арилуглеводородного рецептора в активации и дифференцировке клеток Th27

  • Эстер Барича
  • , Виола Тамаши
  • , Николетт Мартон
  • , Эдит И. Бузас
  • и Дьердь Надь

  Клеточные и молекулярные науки о жизни
  (2016)

Как эффективно использовать t-SNE

Хотя графики t-SNE чрезвычайно полезны для визуализации многомерных данных, они иногда могут быть загадочными или вводящими в заблуждение.Изучая, как он ведет себя в простых случаях, мы можем научиться использовать его более эффективно.

play_arrow пауза
обновить

Шаг

Популярным методом исследования многомерных данных является метод t-SNE, введенный ван дер Маатеном и Хинтоном в 2008 году [1]. Этот метод получил широкое распространение в области машинного обучения, поскольку он обладает почти волшебной способностью создавать убедительные двумерные «карты» из данных с сотнями или даже тысячами измерений. Хотя эти изображения впечатляют, они могут быть соблазнительными для неправильного понимания. Цель этой заметки — предотвратить некоторые распространенные ошибки при чтении.

Мы рассмотрим серию простых примеров, чтобы проиллюстрировать, что диаграммы t-SNE могут и чего не могут показать. Метод t-SNE действительно полезен, но только если вы знаете, как его интерпретировать.

Прежде чем приступить к делу: если вы раньше не сталкивались с t-SNE, вот что вам нужно знать о математике, лежащей в основе этого. Цель состоит в том, чтобы взять набор точек в пространстве большой размерности и найти точное представление этих точек в пространстве меньшей размерности, обычно в 2D плоскости.Алгоритм является нелинейным и адаптируется к базовым данным, выполняя различные преобразования в разных регионах. Эти различия могут стать серьезным источником путаницы.

Вторая особенность t-SNE — это настраиваемый параметр «недоумение», который говорит (в общих чертах), как сбалансировать внимание между локальными и глобальными аспектами ваших данных. Параметр в некотором смысле является предположением о количестве ближайших соседей каждой точки. Значение недоумения оказывает комплексное влияние на получаемые изображения.В исходной статье говорится: «Производительность SNE довольно устойчива к изменениям сложности, а типичные значения находятся в диапазоне от 5 до 50». Но история более тонкая, чем это. Получение максимальной отдачи от t-SNE может означать анализ нескольких графиков с разной степенью сложности.

Это еще не конец сложностей. Например, алгоритм t-SNE не всегда дает аналогичный результат при последовательных запусках, и есть дополнительные гиперпараметры, связанные с процессом оптимизации.

1. Эти гиперпараметры действительно важны

Давайте начнем с «приветственного мира» t-SNE: набора данных из двух сильно разделенных кластеров. Чтобы упростить задачу, мы рассмотрим кластеры в 2D-плоскости, как показано на диаграмме слева. (Для ясности, два кластера имеют цветовую кодировку.) На диаграммах справа показаны графики t-SNE для пяти различных значений сложности.

При значениях недоумения в диапазоне (5–50), предложенных van der Maaten и Hinton, диаграммы действительно показывают эти кластеры, хотя и с очень разными формами.За пределами этого диапазона все становится немного странно. При недоумении 2 преобладают локальные вариации. Изображение для недоумения 100 с объединенными кластерами иллюстрирует ловушку: для правильной работы алгоритма недоумение действительно должно быть меньше количества точек. В противном случае реализации могут привести к неожиданному поведению.

Каждый из приведенных выше графиков был построен с помощью 5000 итераций со скоростью обучения (часто называемой «эпсилон») 10 и достиг точки стабильности к шагу 5000.Насколько важны эти ценности? По нашему опыту, самое важное — повторить итерацию до достижения стабильной конфигурации.

На изображениях выше показаны пять различных прогонов с недоумением 30. Первые четыре были остановлены до стабилизации. После 10, 20, 60 и 120 шагов вы можете увидеть макеты с кажущимися одномерными и даже точечными изображениями кластеров. Если вы видите график t-SNE со странными «защемленными» формами, скорее всего, процесс был остановлен слишком рано. К сожалению, не существует фиксированного количества шагов, дающего стабильный результат.Для схождения разных наборов данных может потребоваться разное количество итераций.

Другой естественный вопрос: дают ли разные прогоны с одинаковыми гиперпараметрами одинаковые результаты. В этом простом примере с двумя кластерами и в большинстве других, которые мы обсуждаем, несколько прогонов дают одну и ту же глобальную форму. Однако некоторые наборы данных дают заметно разные диаграммы при разных прогонах; мы приведем пример одного из них позже.

С этого момента, если не указано иное, мы будем показывать результаты 5000 итераций.Обычно этого достаточно для конвергенции (относительно небольших) примеров в этом эссе. Однако мы продолжим показывать ряд затруднений, поскольку это, кажется, имеет большое значение в каждом случае.

2. Размеры кластеров на графике t-SNE ничего не значат

Пока все хорошо. Но что, если эти два кластера имеют разные стандартные отклонения и такие разные размеры? (Под размером мы подразумеваем измерения ограничивающего прямоугольника, а не количество точек.) Ниже приведены графики t-SNE для смеси гауссиан на плоскости, где один в 10 раз диспергирован, чем другой.

Удивительно, но два кластера выглядят примерно одинакового размера на графиках t-SNE.
В чем дело? Алгоритм t-SNE адаптирует свое понятие «расстояния» к вариациям региональной плотности в наборе данных. В результате он естественным образом расширяет плотные кластеры и сжимает редкие, выравнивая размеры кластеров. Чтобы было ясно, это другой эффект, чем обычный факт, что любой метод уменьшения размерности будет искажать расстояния. (В конце концов, в этом примере все данные изначально были двумерными.) Скорее выравнивание плотности происходит намеренно и является предсказуемой особенностью t-SNE.

Суть в том, что вы не можете увидеть относительные размеры кластеров на графике t-SNE.

3. Расстояние между кластерами может ничего не значить

А как насчет расстояний между кластерами? На следующих диаграммах показаны три гауссиана по 50 точек каждый, причем одна пара находится в 5 раз дальше друг от друга.

При недоумении 50 диаграмма дает хорошее представление о глобальной геометрии.При меньших значениях сложности кластеры выглядят равноудаленными. Когда недоумение равно 100, мы видим, что глобальная геометрия прекрасна, но один из кластеров ошибочно кажется намного меньше, чем другие.
Поскольку недоумение 50 дало нам хорошую картину в этом примере, можем ли мы всегда установить недоумение равным 50, если мы хотим видеть глобальную геометрию?

К сожалению, нет. Если мы добавим больше очков к каждому кластеру, недоумение должно увеличиться, чтобы это компенсировать. Вот диаграммы t-SNE для трех гауссовых кластеров с 200 точками в каждом вместо 50.Теперь ни одно из значений пробной сложности не дает хорошего результата.

Плохая новость, что видение глобальной геометрии требует тонкой настройки. В реальных данных, вероятно, будет несколько кластеров с разным количеством элементов. Может не быть одного значения недоумения, которое фиксировало бы расстояния между всеми кластерами, и, к сожалению, недоумение является глобальным параметром. Решение этой проблемы может быть интересной областью для будущих исследований.

Основная идея состоит в том, что расстояния между хорошо разделенными кластерами на графике t-SNE могут ничего не значить.

4. Случайный шум не всегда выглядит случайным.

Классическая ловушка — думать, что вы видите закономерности в том, что на самом деле является просто случайными данными. Распознавать шум, когда вы его видите, является критически важным навыком, но для формирования правильной интуиции требуется время. Сложность t-SNE заключается в том, что он выкидывает из окна большую часть существующей интуиции.
Следующие диаграммы показывают действительно случайные данные, 500 точек, взятых из единичного распределения Гаусса в 100 измерениях. Левое изображение — это проекция на первые две координаты.

Сюжет с недоумением 2, кажется, показывает драматические скопления. Если бы вы настраивали недоумение, чтобы выявить структуру данных, вы могли бы подумать, что сорвали джекпот.

Конечно, поскольку мы знаем, что облако точек было сгенерировано случайным образом, у него нет статистически интересных кластеров: эти «сгустки» не имеют смысла. Если вы посмотрите на предыдущие примеры, то увидите, что низкие значения недоумения часто приводят к такому типу распределения. Распознавание этих сгустков как случайного шума — важная часть чтения графиков t-SNE.

Но есть кое-что еще интересное, что может стать победой для t-SNE. Поначалу график недоумения 30 совсем не похож на гауссово распределение: есть лишь небольшая разница в плотности в разных областях облака, и точки кажутся подозрительно равномерно распределенными. Фактически, эти особенности говорят полезные вещи о многомерных нормальных распределениях, которые очень близки к однородным распределениям на сфере: равномерно распределены, с примерно равными промежутками между точками.В этом свете график t-SNE более точен, чем любая линейная проекция.

5. Вы можете увидеть какие-то фигуры, иногда

Редко когда данные распределяются идеально симметричным образом. Давайте посмотрим на выровненное по оси распределение Гаусса в 50 измерениях, где стандартное отклонение по координате i равно 1 / i. То есть мы смотрим на длинное эллипсоидальное облако точек.

При достаточно высоких значениях сложности удлиненные формы легко читаются.С другой стороны, при низком уровне недоумения центральное место занимают локальные эффекты и бессмысленное «слипание». Проявляются и более экстремальные формы, но опять же только при правильном затруднении. Например, вот два кластера по 75 точек в каждом в 2D, расположенные параллельными линиями с небольшим шумом.

Для определенного диапазона недоумений длинные кластеры выглядят близко к правильным, что обнадеживает.

Однако даже в лучших случаях наблюдается небольшое искажение: линии на диаграмме t-SNE слегка изогнуты наружу.Причина в том, что, как обычно, t-SNE имеет тенденцию расширять более плотные области данных. Поскольку середины кластеров имеют меньше пустого пространства вокруг них, чем концы, алгоритм увеличивает их.

6. Для топологии может потребоваться более одного участка

Иногда вы можете прочитать топологическую информацию с графика t-SNE, но для этого обычно требуются виды с множеством трудностей.
Одно из простейших топологических свойств — вложение. На графиках ниже показаны две группы по 75 точек в 50-мерном пространстве.Оба взяты из симметричных гауссовских распределений с центром в начале координат, но одно в 50 раз более сильно диспергировано, чем другое. «Маленькое» распределение фактически содержится в большом.

Вид недоумения 30 правильно показывает основную топологию, но снова t-SNE сильно преувеличивает размер меньшей группы точек. В недоумении 50 возникает новый феномен: внешняя группа становится кругом, поскольку сюжет пытается изобразить тот факт, что все ее точки находятся примерно на одинаковом расстоянии от внутренней группы.Если вы посмотрите только на это изображение, было бы легко неправильно истолковать эти внешние точки как одномерную структуру.

А как насчет более сложных типов топологии? Это может быть предметом более дорого для математиков, чем для практических аналитиков данных, но интересные низкоразмерные структуры иногда встречаются в дикой природе.

Рассмотрим набор точек, которые отслеживают связь или узел в трех измерениях. Еще раз, просмотр нескольких значений недоумения дает наиболее полную картину.Низкие значения недоумения дают два полностью отдельных цикла; высокие показывают своего рода глобальную связь.

Узел-трилистник — интересный пример того, как несколько прогонов влияют на результат t-SNE. Ниже приведены пять прогонов обзора недоумения-2.

Алгоритм дважды останавливается на окружности, которая, по крайней мере, сохраняет внутреннюю топологию. Но в трех прогонах получается три разных решения, которые вводят искусственные перерывы. Используя цвет точки в качестве ориентира, вы можете увидеть, что первый и третий прогоны находятся далеко друг от друга.

Однако пять прогонов с недоумением 50 дают результаты, которые (с точностью до симметрии) визуально идентичны. Очевидно, некоторые проблемы легче оптимизировать, чем другие.

Заключение

Существует причина, по которой t-SNE стал настолько популярным: он невероятно гибкий и часто может находить структуру, недоступную другим алгоритмам уменьшения размерности. К сожалению, из-за такой гибкости его сложно интерпретировать. Вне поля зрения пользователя алгоритм вносит всевозможные корректировки, приводящие в порядок визуализацию.Однако не позволяйте скрытой «магии» отпугнуть вас от всей техники. Хорошая новость заключается в том, что, изучая поведение t-SNE в простых случаях, можно развить интуицию в отношении происходящего.