Лада 21 0 8: Купить LADA (ВАЗ) 2108 с пробегом: продажа автомобилей Лада 2108 б/у

Содержание

кабриолет Natasha — Российская газета

Журналист и видеоблогер Иван Зенкевич рассказал о редкой модификации ВАЗ-2108 — кабриолете Lada Natasha. Белый экземпляр 1993 года выпуска является реэкспортной версией из Канады.

Кабриолет на базе Lada Samara был придуман в 1990 году бельгийской компанией «Скалдия-Волга», которая в те годы занималась экспортными поставками российских автомобилей. Обычные ВАЗ-2108 экспортировали за границу, где уже местные дилеры переделывали трёхдверку в кабриолет. Мелкосерийную сборку автомобилей осуществляли специализированные кузовные фирмы в Бельгии и Германии.

Несущий кузов кабриолета усилен за счёт силового каркаса и дуги безопасности. В результате жесткость кузова открытой Lada Natacha оказалась на уровне хэтчбека Lada Samara, а в некоторых местах даже выше. Автомобиль оснащался тканевым складывающимся верхом и механизмом его складывания. В итоге масса автомобиля возросла на 70 кг.

Фото: скриншот с youtube.com

За внешний вид «Наташи» отвечал тольяттинский дизайнер Владимир Ярцев. Снаружи кабриолет получил оригинальную переднюю маску, другую бамперную группу, иные пороги, боковые молдинги, а также свои литые колёсные диски, хромированный патрубок выхлопной трубы, накладку на номерной площадке и свою крышку багажника из стеклопластика. Четырёхместный салон имеет снимаемый спортивный руль, кожаные сиденья и такой же диван.

По технике Lada Natasha не отличался от «восьмёрки». Под капотом кабриолета расположился 8-клапанный «карбюратор» ВАЗ-21083 объемом 1,5 литра и мощностью 73 л.с. Дополнительно установили каталитический нейтрализатор и усиленный генератор.

С 1990 года по 1995 год было выпущено лишь около 456 кабриолетов. Все они были реализованы во Франции, Германии, Бельгии и Венгрии. Открытая версия ВАЗ-2108 оказалась дороже обычного хэтчбека примерно в 1,5 раза. К примеру, во Франции Lada Samara стоила 53,7 тысячи франков, а Lada Natasha можно было приобрести за 79,9 тысяч франков.

Фото: скриншот с youtube.com

Напомним, серийное производство ВАЗ-2108 началось в 1984 году, последняя трёхдверка сошла с конвейера Тольяттинского автозавода в 2004 году. После чего модель собиралась из машинокомплектов на Запорожском автомобильном заводе в период с 2004 по 2014 годы.

АО Чебоксары-Лада — дилер LADA в г. Новочебоксарск

АВТОВАЗ: 35 ЛЕТ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОМУ ЦЕНТРУ

4 сентября исполняется 35 лет с момента выхода правительственного постановления о создании на АВТОВАЗе отраслевого научно-технического центра. Комплекс конструкторских служб и лабораторий, многие из которых уникальны в масштабах страны, успешно работает и сегодня – и является основой службы инжиниринга АВТОВАЗа.Служба инжиниринга АВТОВАЗа – это не только комплекс лабораторий, но и сложившийся высокопрофессиональный коллектив, способный решать сложные задачи. Потенциал и компетенции НТЦ АВТОВАЗа высоко ценится в рамках Renault Group. Именно поэтому принято решение, что АВТОВАЗ и его инженеры внесут значительный вклад в план Renaulution – новую стратегию развития Renault Group. LADA планирует усилить свой продуктовый план пятью новыми моделями до 2025 года, включая новое семейство автомобилей B-сегмента и полностью новое поколение Niva. При этом будет использована высококонкурентная по стоимости и гибкая платформа Альянса CMF-B, которую планируется в значительной степени локализовать. Одновременно с проектированием новых автомобилей проводится модернизация выпускаемых моделей: внедряются новые системы безопасности и комфорта, в частности, это сервисы подключенных автомобилей.Реализация новых проектов потребует усиление инженерного потенциала АВТОВАЗа. Для развития компетенций службы инжиниринга и реализации среднесрочного плана обновления модельного ряда LADA, Компания укрепляет кооперацию с ВУЗами как в Самарской области, так и за ее пределами, популяризирует автомобильную индустрию в молодежной студенческой среде. Сегодня генеральные договоры о сотрудничестве заключены с университетами Тольятти, Самары, Томска, Санкт-Петербурга и Москвы. АВТОВАЗ продолжает набор как выпускников вузов, так и высококвалифицированных специалистов: с 2017 года на завод устроилось работать более тысячи молодых сотрудников из разных регионов России.НТЦ: историяКонструкторская служба АВТОВАЗа начала формироваться еще в конце 1960-х гг, в период запуска автозавода и освоения первой модели, ВАЗ-2101 – модернизация лицензионного автомобиля проходила с участием вазовских инженеров. С тех пор были реализованы и другие значимые для страны проекты, среди которых – развитие «классического» заднеприводного семейства, разработка автомобиля «Нива», переднеприводного семейства «Самара». Проведена работа над концептуальными проектами, в частности, над автомобилями на альтернативных источниках энергии – эти и многие другие проекты сегодня демонстрируются в корпоративном музее АВТОВАЗа в Тольятти.В 1986 году служба главного конструктора АВТОВАЗа начала трансформацию в отраслевой научно-технический центр – сохранив ключевые компетенции, подразделение получило новые возможности и материально-техническую базу. Проект НТЦ создавали специалисты, которым впоследствии предстояло здесь работать. Многие объекты (аэродинамическая труба, аэроклиматический комплекс, комплекс электромагнитной совместимости, камера по исследованию шумов) были созданы с использованием передового мирового опыта.В концепции НТЦ был заложен мощный потенциал для разработки новых моделей и организации технологической подготовки процессов их производства. Как и все производство АВТОВАЗа, инжиниринговый центр в настоящее время проходит трансформацию в соответствии со стандартами Renault Group.НТЦ: основные лабораторииДля проектирования автомобилей в службе инжиниринга АВТОВАЗа работает комплекс подразделений, где создаются все основные узлы и агрегаты: кузов, двигатель, трансмиссия, подвеска, интерьер, электрооборудование и тд. Все создаваемые концепции проверяются на дорогах и в испытательных лабораториях.Комплекс испытательных автодорог: одним из основных его объектов является скоростная кольцевая профилированная трасса протяженностью 10 километров, имеющая овальную форму и ширину проезжей части 12 метров. Максимальная скорость, на которой могут проводиться испытания, составляет 325 км/ч. Внутри овала расположен комплекс специальных дорог для проверки и настройки управляемости, уровня комфорта, шумов, вибраций. Здесь анализируется поведение автомобиля в летних и зимних условиях, проводятся топливно-скоростные и ресурсные испытания. Часть этих трасс изолирована от воздействия внешней среды, что повышает точность результатов тестов.Аэродинамическая труба, единственная лаборатория такого класса в России, и одна из немногих в мире, позволяет производить испытания автомобилей разных классов, а также других объектов, например, макетов зданий. Вентилятор диаметром в 7,4 метра создает поток воздуха скоростью до 216 км/час. Прижимную или подъемную силы измеряют весы – настолько чувствительные, что, если на автомобиль положить монету, система покажет изменения показателей. В аэродинамическом комплексе результате можно не только произвести необходимые замеры сил и моментов, действующих на объект, но и выработать рекомендации по оптимизации поверхностей.Аэроклиматическая камера позволяет испытывать автомобиль в различных климатических условиях, независимо от времени года. Внутри камеры можно имитировать мороз, жару, тропический ливень, снегопад. Это позволяет оперативно испытывать различные системы автомобиля, например, оценить эффективность работы климатической установки или системы обогрева зеркал.Камера испытаний на электромагнитную совместимость: здесь проверяют и совершенствуют электрооборудование автомобилей. В лаборатории электромагнитной совместимости АВТОВАЗа действует экранированная безэховая камера – одна из самых больших в мире, что позволяет вести исследования в широком диапазоне волн. Стены камеры покрыты пирамидами-абсорберами, которые гасят и звуки, и электромагнитные волны. В лаборатории возможна имитация электромагнитных полей практически от любых существующих источников, от сотовых телефонов, до высоковольтной ЛЭП.Лаборатория виброакустических испытаний представляет собой автономное сооружение: специальный фундамент комплекса изолирует его от возможных шумов и вибраций извне. В испытательных камерах можно тестировать автомобиль в разных режимах движения, при этом стены лаборатории покрыты специальным звукопоглощающим материалом, исключающим возможность появления эха. Все это позволяет с максимальной точностью рассчитывать уровень шума, издаваемого автомобилем, а также шумов внутри него.Лаборатория краш-тестов – это лучший из 2-х комплексов ударных испытаний, имеющихся в России. Здесь можно смоделировать большинство сценариев столкновений, которые случаются в реальной жизни, а также проводить омологационные и сертификационные испытания. В частности, это фронтальный удар о жесткий или деформируемый барьер, удар в автомобиль сбоку и сзади, удар о столб. Высокоточное оборудование, а также интерактивные манекены последнего поколения позволяют получить исчерпывающую информацию о повреждениях самого автомобиля и его пассажиров – это дает возможность проектировать автомобили в соответствии с высокими стандартами безопасности. Помимо испытаний LADA, служба инжиниринга АВТОВАЗа проводит тесты других автомобилей по заказам партнеров, а также испытания автокомпонентов – для отбора комплектующих изделий необходимого качества._______Дополнительная информацияЗа 35 лет в НТЦ были созданы следующие проекты серийных автомобилей: семейство LADA 110 (1995-2007), ВАЗ-2123 (Niva, второе поколение, производство с 2000 года), семейство LADA Kalina (2004-2011), LADA Priora (2007-2018), семейство LADA Granta (производство с 2011 года), LADA Vesta (производство с 2015 года), LADA XRAY (производство с 2015 года).

Коды ошибок ВАЗ 2114 и ВАЗ 2115 с расшифровкой

Оглавление:
1. Диагностика
1.1 Самодиагностика ВАЗ 2114
1.2 Проверка при помощи диагностического оборудования
2. Основные коды ошибок ВАЗ 2114 инжектор: расшифровка
2.1 Система выпуска – 0000
2.2 Дефекты воздушной магистрали – 0100
2.3 Коды ошибок, связанные с подачей топлива – 0200
2.4 Коды ошибок бортового компьютера, свидетельствующие о поломках в системе зажигания – 0300
2.5 Дополнительная навеска, не имеющая непосредственного влияния на мотор – 0400
2.6 Отказ, неполадки в системе управления оборотов СУ – 0500
2.7 Бортовая сеть вспомогательного или основного оборудования – 0600
2.8 Вспомогательные системы – 1000
3 Как устранить поломку
4. Итог

Российский автоконцерн ВАЗ выпускает достаточный ассортимент автомобилей. Модели бренда пользуются большим спросом среди отечественных автолюбителей и на территории стран СНГ. Популярность вызвана ввиду умеренной стоимости и дешевого ремонта машин. Однако проблемы случаются с любыми ТС и продукция завода не исключение. Коды ошибок ВАЗ 2114 инжектор, могут сориентировать автомобилиста касательно области поломки и помочь в устранении проблем.

Диагностика

Установить коды ошибок ВАЗ 2114 инжектор 8 клапанов можно двумя путями. При этом каждый метод имеет уникальные преимущества и минусы.

Самодиагностика ВАЗ 2114: коды ошибок и их расшифровка

Способ самодиагностики не требует от водителя наличия сложных приборов или дополнительных агрегатов. Для выполнения процедуры достаточно самого автомобиля.

Стандартная последовательность действий выглядит так.

  1. Вдавить клавишу сброса одометра.
  2. Перевести ключ зажигания в положение №1 (включить бортовую электрику).
  3. Освободить кнопку сброса пробега. После этого стрелки приборов сделают полный оборот, и вернутся на место.
  4. Второй раз вдавить клавишу сброса и отпустить. Команда вызывает на дисплей показатель версии прошивки.
  5. Повторить пункт №4 – это вызовет на экран коды ошибок бортового компьютера.

Если последовательность действий выполнена верно, все индикаторы загорятся, а дисплей выдаст двузначный код неисправности.

Примечание! Сигналом неисправности может стать отсутствие отклика от индикатора. При этом, необходимо проверить цепь, идущую от прибора.

Самые распространенные коды ошибок панели ВАЗ 2114, встречающиеся в 90% случаев:

  • 1 – сбой микропроцессора, требуется перепрошивка;
  • 2 – код ошибки 2 ВАЗ 2114 свидетельствует о том, что налицо перебой или нарушение проводки датчика поплавка внутри бензобака;
  • 4 – КЗ электропроводки, превышен предел напряжения;
  • 8 – код ошибки 8 на ВАЗ 2114 указывает на упадок вольтажа в сети, возможно сел аккумулятор;
  • 12 – в ВАЗ 2114 код ошибки 12 говорит о том, что неправильно функционирует контрольная лампа;
  • 13 – обрыв цепи датчика кислорода;
  • 14 – код ошибки 14 на ВАЗ 2114 предупреждает водителя о том, что произошел перегрев мотора или замыкание сенсора температуры антифриза;
  • 15 – замыкание или вышел из строя ДТОЖ;
  • 16 – превышение допустимого предела вольтажа бортовой сети;
  • 17 – критически упало напряжение БС, допускается разряд АКБ;
  • 19 – не реагирует ДПКВ или произошло замыкание на линии;
  • 21-22 – некорректное реагирование ДПДЗ, возможно замыкание или обрыв проводки;
  • 23/25 – КЗ датчика положения дроссельной заслонки;
  • 24 – поломка спидометра, возможно, перебиты силовые жилы;
  • 27/28 – износился или сломан датчик СО;
  • 33/34 – неполадки ДМРВ, возможет обрыв питания или замыкание;
  • 35 – отказал сенсор РХХ, лечится только полной заменой;
  • 41 – неправильное распределение фаз накрылся или замкнул;
  • 42 – отказала цепь или перебиты провода блока электронного зажигания;
  • 43 – неисправен сенсор детонации смеси;
  • 44/45 – нарушение подачи топлива в двигатель, система может троить, появляются рывки при ускорении, плохо набирает обороты;
  • 51 – барахлит ПЗУ;
  • 52 – аналогично для ОЗУ;
  • 53 – отказ потенциометра;
  • 54 – разрыв проводки на октан корректор;
  • 55 – чрезмерное обеднение смеси вовремя разгона;
  • 61 – перебои в работе лямбда-зонда.

В некоторых случаях допускается накладывание ошибок друг на друга при аналогичности поломки. Для примера, если ошибки 1 и 4 пересекаются, панель укажет «5».

Важно знать, что после просмотра коды ошибок ВАЗ 2114/2115 не пропадают самостоятельно после выполнения ремонта. Их требуется принудительно сбросить. Для выполнения работы потребуется простая последовательность действий:

  • включить зажигание автомобиля;
  • снять клеммы с аккумулятора;
  • выждать 20-30 секунд;
  • вернуть зажимы на место.

Это также необходимо проделать, если планируется поездка на СТО. Обнаружив указания бортового компьютера, мастера будут исправлять эти проблемы, что выйдет однозначно дороже.

К минусам самостоятельной процедуры относится малая точность данных. Бортовая диагностика показывает только общий вектор направления, где следует искать неисправность.

Проверка при помощи диагностического оборудования

Выявить коды ошибок ВАЗ 2115 и 2114 можно при помощи ноутбука со специальной программой. Инструмент подключается к тестовой колодке автомобиля через набор переходников. Мастер настраивает ПО, и после диагностики на экране компьютера отобразится одна или несколько неисправностей в виде пятизначного шифра.

Первая часть – буква:

  • В – поломка кузовных панелей;
  • С – неисправности шасси или подвеска;
  • Р – расстройство электрики, двигателя или трансмиссии;
  • U – повреждение клеммы для обмена информацией.

Вторая часть – однозначная цифра:

  • 0 – типичный указатель по стандарту SAE;
  • 1/2 – конвейерный код поломки;
  • 3 – резерв.

Следующий элемент – указатель группы поломки:

  • 1/2 – дефект топливной/ воздушной магистрали;
  • 3 – зажигание и сопутствующие элементы;
  • 4 – катализатор;
  • 5 – ХО силовой установки;
  • 6 – ЭСУД и сопутствующая проводка;
  • 7/8 – блоки трансмиссии.

Окончательные две цифры указывают непосредственно на саму проблему.

Основные коды ошибок ВАЗ 2114 инжектор: расшифровка

Примечание! Таблица также актуальна и для версии 2115.

Система выпуска – 0000

  • 30 – разрыв цепи нагревателя датчика кислорода до каталитического нейтрализатора;
  • 31 – тоже с КЗ на кузов авто;
  • 32 – аналогично с замыканием на 12В;
  • 36-38 – то же значение, что и 30 только для выходящего сенсора.

Дефекты воздушной магистрали – 0100

  • 102/103 – ДМРВ обрыв цепи или нарушение сигнала;
  • 112/113 – магистрали сенсора t˚ за бортом, нарушение импульса;
  • 116 – перегрев двигателя;
  • 117/118 – повреждение цепи ДТОЖ;
  • 122/123 – линия ДПДЗ, замыкание или нарушение изоляции;
  • 130 – поломка датчика кислорода перед катализатором;
  • 131/132 – аналогичный элемент, нарушение уровня сигнала;
  • 133 – замедленный отклик ДК1 на команды;
  • 134 – разрыв силового кабеля питания ДК1;
  • 136 – ДК2 поломан;
  • 137/138 – замыкание или нарушение проводки ДК2;
  • 140 – сгорел предохранитель ДК2;
  • 141 – нагреватель того же прибора сломан или поврежден;
  • 171/172 – чрезмерно обедненная или обогащенная топливная смесь.

Коды ошибок ВАЗ 2114 1,6 литра, связанные с подачей топлива – 0200

  • 201/204 – обрыв магистрали управления форсунками для всех последовательно;
  • 217 – перегрев мотора;
  • 230 – отказал бензонасос или перегорело соответствующее реле;
  • 261/264/267/270 – КЗ цепи управления форсункой на +12 В соответственно для каждой вставки;
  • 263/266/269/272 – отказ или дефект драйвера форсунок для каждой последовательно;
  • 262/265/268/271 – КЗ магистралей на кузов машины.

Коды ошибок бортового компьютера ВАЗ 2114, свидетельствующие о поломках в системе зажигания – 0300

  • 300 – имеются пропуски зажигания;
  • 301-304 – аналогично для каждого цилиндра соответственно;
  • 326-328 – сломан ДДС или отсутствует сигнал;
  • 335-338 – отказ, замыкание или перебой проводки ДПКВ;
  • 342/343/346 – нарушение работы датчика распределения фаз;
  • 351-354 – обрыв КЗ для всех поршней последовательно;
  • 363 – не воспламеняется смесь в цилиндрах, аварийная отсечка подачи топлива.

Дополнительная навеска, не имеющая непосредственного влияния на мотор – 0400

  • 422 – возможно забился катализатор или критически упала проходимость выхлопных газов;
  • 441 – нарушение питания клапана продувки адсорбера;
  • 444 – обрыв питания выше указанного элемента;
  • 445 – замыкание КПА на кузов автомобиля;
  • 480 – повреждены провода питания на главный кулер радиатора;
  • 481 – отказ цепи управления вентилятора ОЖ №2.

Отказ, неполадки в системе управления оборотов СУ – 0500

  • 500 – сенсор спидометра сломан;
  • 506/507 – низкие или высокие обороты ХХ автомобиля;
  • 511 – регулятор ХХ – перебиты магистрали от реле и ЭБУ;
  • 560 – разрядилась батарея или порван силовой кабель.
  • 562/563 – КЗ на бортовой проводке.

Бортовая сеть вспомогательного или основного оборудования – 0600

  • 601 – контроллер ЭСУД, ошибка ПЗУ;
  • 615 – вторичное реле стартера, повреждение проводки;
  • 616/617 – тоже с КЗ на массу или 12В;
  • 627 – управляющее реле бензонасоса, возможен обрыв магистрали;
  • 628/629 – аналогично с замыканием на кузов или бортовую систему;
  • 645-647 – муфта компрессора, повреждение проводки с касанием на корпус или другие кабели;
  • 650 – сломана лампа «Check Engine» проверить двигатель, может быть повреждение проводки;
  • 654 – отказал тахометр;
  • 685-687 – неисправность главного реле управления двигателем, требуется полная замена детали;
  • 691/692 – неполадки с реле главного вентилятора системы охлаждения.

Вспомогательные системы – 1000

  • 102 – пробой нагревателя ДК1;
  • 115 – отказ или сбой вышеуказанного прибора;
  • 123/124 – нарушение, слишком богатая/бедная смесь на холостых оборотах;
  • 127/128 – аналогично, только для частичной нагрузки на ДВС;
  • 135 – разрыв магистрали подогрева ДК1;
  • 136/137 – неправильная подача топлива при малой нагрузке на мотор, возможно барахлит привод дросселя;
  • 140 – несоответствие измеренной и фактической нагрузки;
  • 141 – отказ нагревателя ДК2;
  • 171/172 – неверные сведения поступают от потенциометра;
  • 301-304 – неправильно срабатывает зажигание в цилиндре, последовательно для всех камер сгорания;
  • 386 – неправильная последовательность тестирования канала детонации;
  • 410/425/426 – проводка заслонки продувки адсорбера, КЗ или повреждение линии;
  • 500 – повреждена линия реле топливного насоса;
  • 501/502 – аналогично с КЗ на кузов или проводку;
  • 509/513/514 – ЦУ регулятора ХХ, обрыв или КЗ на борта или 12В;
  • 541 – повреждение провода реле БН, возможно окисление клеммы;
  • 570 – разрыв кабелей управления иммобилайзера;
  • 602 – нет питания на ЭСУД, допускается окисление колодок;
  • 606 – сломан датчик ухабов, нужна замена детали;
  • 616/617 – аналогично с изменением уровня сигнала, возможно внутри прибора имеется КЗ;
  • 2301/2303/2305/2307 – катушки зажигания замкнули на 12 вольт, последовательно для каждого поршня.

Важно! Здесь указаны исключительно самые популярные коды ошибок приборной панели ВАЗ 2114 и аналогичных моделей. Существуют и другие индексы, но ввиду малой распространенности они не упомянуты.

Как устранить поломку

После диагностики следует устранить поломку. При считывании сигнала необходимо проверить цепь и приборы, следующие за ним. Наиболее точный метод – замена поврежденной детали на заведомо исправную (новую). Это исключит вероятность неправильного ремонта. Если прибор в рабочем состоянии, проверяются магистрали, обычно достаточно примитивной прозвонки. Однако при отказе БУ или реле, потребуется специальный тестер и умение ним пользоваться.

Отдельно требуется учесть, что заводские клеммы и колодки со временем разбалтываются и окисляются. Если на сцепке ухудшается контакт, бортовой компьютер или программа ноутбука будет говорить, что деталь повреждена, даже если это не так.

Предотвратить подобное можно следующим образом.

  1. Один раз на 5000 км пробега проверять состояние разъемов. Колодки должны сидеть на месте плотно, без люфтов. При необходимости элементы необходимо заменить новыми.
  2. Два-три раза в год проверять штепсельные разъемы на предмет окисления. Оксиды снижают проходимость электричества по бортовой проводке, что влечет некорректное отображение информации.
  3. Специалисты рекомендуют купить и использовать масло для электрических клемм. Жидкость сходна по составу с трансформаторными лубрикантами. Формула не допускает воду и кислород к металлам, что препятствует их ржавлению.

Важно! Диагностику кодов ошибок ВАЗ 2114 на панели приборов и ЭБУ можно выполнить самостоятельно, исключительно при понимании сути процесса. Если уверенности в собственных силах нет – рекомендуется обратиться к квалифицированному мастеру.

Итог

При наличии соответствующих знаний, и необходимого оборудования найти и правильно расшифровать коды ошибок инжектора ВАЗ 2115 и других элементов можно самостоятельно. Благодаря простоте электрической схемы автомобиля, от пользователя не требуется глубоких познаний в механике или электронике.

Слава в соцсетях: новой «Ладе» придумывали имя всем миром («Известия»)

«АвтоВАЗ» подвел итоги конкурса на название новой модели Lada, причем в каждой соцсети выбрали свой вариант. Как теперь назовут новинку и от чего это зависит. Кто придумывал название для «восьмерки» и как расшифровывается «Нива». В особенностях российского нейминга разбирались «Известия».

«АвтоВАЗ» выбрал победителя в каждой соцсети. «ВКонтакте» лучшим признали вариант Onega, в Faceebook – имя Slava, в Instagram – Alta, а в «Одноклассниках» – Lika. Это не первый раз, когда Волжский автозавод идет в народ.

Фиалка, я Сокол!

Имя для ВАЗ-2101 придумывали всем Союзом, читатели журнала «За рулем» прислали 50 тыс. вариантов на конкурс – «Сокол», «Фиалка», «Катюша», «Руслан», «Атаман», «Аргамак» и так далее. Встречались и странные имена – «Директивец», «Новорожец».

Было множество предложений назвать автомобиль «Лада», но в итоге на заводе склонились к варианту «Жигули», предложенным вазовским испытателем Алексеем Черным. И зря не послушали народное мнение – имя оказалось вычурным, а для некоторых зарубежных рынков еще и неблагозвучным.

«Можно себе представить, что получится, если выйдут в свет «Жигули»: «Наш завод приобрел пять «Жигулей»!» Или: «Я собираюсь купить «Жигулю»!» Или: «С невыразимым чувством радости сел я за руль своей «Жигули» (А может быть, «Жигулихи»), – писал возмущенный читатель журнала «За рулем».

В итоге для экспортных рынков ВАЗ-2101 переименовали в нейтральную Lada, а в народе машину прозвали «Единичкой», а позже «Копейкой».

Спутник, который не взлетел

Имя для первого переднеприводного автомобиля ВАЗ-2108 утвердил сам главный конструктор «АвтоВАЗа» Георгий Мирзоев.

«Дизайнеры дали на конструкторскую разработку графику с названием «Спутник». Мы разработали чертеж орнамента двери задка, принес я его на подпись к Мирзоеву и говорю ему: «Георгий Константинович, ведь название «Спутник» еще не утверждено». На что последовал ответ: «Пусть привыкают». И чертеж был подписан», – вспоминал конструктор Георгий Троицкий (цитируется по книге «Высокой мысли пламень»).

Современный на тот момент автомобиль, разработанный совместно с Porsche, вполне заслуживал такого названия.

«Для нашей страны это такой же повод для гордости, как первый спутник», – пишет Владимир Мельников из «Авторевю».

Однако имя «Спутник» не прижилось и в народе машину прозвали «восьмеркой» или «зубилом» – за странный «клюв» на решетке радиатора. Следующая модель – пятидверный хетчбэк-2109 получила новое название «Самара», которое затем распространили на всё семейство машин. Впрочем, параллельно машины продолжали неофициально именовать по индексу модели – «восьмеркой», «девяткой», а седан – «девяносто девятой».

В итоге следующее поколение вазовских машин осталось без дополнительного имени и называлось просто «десятым» семейством по индексу головной модели – седана 2110.

Нива и крокодил

Прототип внедорожника будущей «Нивы» испытатели прозвали «Крокодилом Геной» – за приземистый кузов зеленого цвета. Тем более что на заводе проходил испытания другой прототип «Чебурашка» – переднеприводная микролитражка.

Название «Нива» вообще появилось как аббревиатура из первых букв имен детей конструкторов Петра Прусова и Владимира Соловьева – Наташа, Ирина, Вадим, Андрей. Вазовцам даже пришлось обращаться за разрешением на завод «Ростсельмаш», который уже выпускал под именем «Нива» комбайн, но хлопоты того стоили. Название отлично подходило легковому внедорожнику и намекало на сельские просторы, основной регион его обитания. И оказалось очень успешным – «Нива» была единственной моделью Волжского автозавода, которую не именовали по индексу.

Концерн General Motors, заключая с «АвтоВАЗом» соглашение о совместном производстве внедорожника, приобрел и права на бренд «Нива». Таким образом, новая модель называлась Chevrolet Niva, а старую переименовали в Lada 4×4. Только в прошлом году «АвтоВАЗу» с выкупом американской доли в совместном предприятии удалось вернуть права на ставший легендарным бренд.

Надежда умирает первой

А вот минивэн «Надежда» –полноприводный однообъемник на базе «Нивы», в буквальном смысле не оправдал надежд. Силуэт машины стал развитием футуристических концептов ВАЗа, прозванных «бананами». Концепция полноприводного минивэна вообще была необычной для 1990-х, однако подвело исполнение.

Автомобиль готовили в крайней спешке и вместо первоначально задуманных узких фар наградили его четырьмя круглыми. За пучеглазость машину прозвали в народе «Надежда Константиновка», но рестайлинг ничего не изменил. Качество сборки хромало и перевешивало все связанные с практичностью машины плюсы. Кроме того, себестоимость минивэна оказалась очень высокой и в 2006-м ВАЗ свернул его производство, выпустив чуть больше 8 тыс. штук.

Изменить приоритет

 

В конце 2003 года все автомобили Волжского завода были переименованы из «ВАЗов» в «Лады». Появилось и новое имя – «Калина». Его придумал дизайнер машины Евгений Лобанов. Название звучало несколько наивно, но сочеталось с мягкими линиями кузова. С этого момента «АвтоВАЗ» снова почувствовал вкус к неймингу и поручил агентству BBDO Instinct придумать имя для рестайлинговой «десятки».

«Мало кто знает, что в 250 отобранных наименований для составления шорт-листа изначально не входило имя Priora. Но там был вариант Prioritet. Мне он показался неплохим, но длинноватым для написания на крышке багажника. Да и в сочетании с Lada Proiritet выглядел немного несбалансированным. Поэтому при составлении своего варианта шорт-листа я изменил Prioritet на Priora и направил коллегам из BBDO с соответствующими комментариями, – вспоминает бывший начальник управления по маркетингу «АвтоВАЗа» Александр Бредихин. Он отстоял свой вариант и Priora неожиданно для всех победила в фокус-группах.

 «Приора» создала стандарт для успешного имени «Лады» – слово с латинскими корнями из двух трех слогов и с окончанием на букву «а». Исключение из правил – модели, созданные на платформах Renault-Nissan, Xray и Largus.

Кроме того, название Priora без разночтений писалось латинским шрифтом, на который в к тому времени перешел ВАЗ.

Гранта, Веста и…

Неудивительно, что в очередном конкурсе «Народной машине – народное название» победил вариант Granta, предложенный Павлом Захаровым из Красноярска. Имя Vesta, за которое проголосовали несколько сотен участников конкурса, агентство BrandLab позже использует для следующей модели «АвтоВАЗа».

Как назовут новую модель Lada – «Слава», «Альта», «Лика» или «Онега». В пресс-службе «АвтоВАЗа» рассказали «Известиям», что передадут шорт-лист новых продуктовой группе, но будут ли они использоваться или нет, пока неизвестно.Кроме того, в мае российский автопроизводитель зарегистрировал в базе «Роспатента» три новых названия для своих моделей – Tensa, Forta и Kayna.

Может не понравится «Опелю»

Из выбранных в соцсетях имен разве что «Слава» вызовет вопросы, считает главный редактор «За рулем» Максим Кадаков. И действительно, непонятно, какая слава закрепится за новой моделью.

«Очень неплохо в таких случаях подходят географические названия. У людей меньше возможностей их коверкать. Например, Волга, Ока. Лада может быть «Онегой», – сказал Кадаков. По его словам, сейчас для названий автомобилей хорошо подходят и придуманные слова.

«Любое название нужно прокачивать через международные базы. Были случаи, когда что-то пришлось менять. Самый классический – с моделью Ижевского автозавода ИЖ «Орбита», который пришлось переименовывать в «Оду», потому что имя оказалось занятым, – рассказал «Известиям» автоэксперт Игорь Моржаретто.

Иногда проблемы случаются даже с отдаленно похожими названиями, как это было, например, с брендом Aurus. Так что имя Onega может не понравиться «Опелю», у которого есть в запасе Omega, а Alta – Suzuki с его Alto.

Максим Кадаков вспомнил недавнюю историю, когда Chery не дали зарегистрировать в России бренд Exeed, так как у Kia уже была модель Xceed. Пришлось писать название новой марки слитно: CheryExeed. Так что выбор имени для новой «Лады» теперь в руках юристов и маркетологов, считает Кадаков.

Все цвета окраски кузовов Автоваз


У автомобилей марки Автоваз огромное количество различных расцветок окраски кузовов. Причём столько же много и названий, по которым трудно понять какой-же это цвет. Полный каталог цветов можно увидеть в этой статье


Очень легко смутиться, если услышать, что цвет автомобиля «Рапсодия» или «бургундия» и не понять, так какого же цвета этот авто? В качестве решения данной проблемы предлагаем вам таблицу-каталог всех цветов автомобилей производства АвтоВАЗ.

Отправь себе в социальную сеть, пригодится!

Цвета по моделям:


Другие модели


Показать только определенные цвета:


Красные
Синие
Белые
Оранжевые
Зеленые
Черные


Найдено цветов Автоваз: 0. Смотрите ниже

Очистить


КодНаименованиеПримерный видОписаниеПример на авто

Полный каталог цветов Автоваз

Всего цветов: 0

Быстрый поиск:

Либо воспользуйтесь штатными средствами поиска вашего браузера:

Если Ваш браузер — Opera или Mozilla, то выберите в верхнем меню Правка — Найти, либо просто нажав Ctrl+F.

Если Ваш браузер — Google Chrome, то выберите в Меню пункт Найти, либо просто нажав Ctrl+F.

Если Ваш браузер — Internet Explorer, то нажмите Ctrl+F.




















































































КодНаименованиеПримерный видОписаниеПример на авто
290Южный крест серо-бежевыйВАЗ 2114
295Сливочно-белый сливочно-белый
301Серебристая ива серебристый-зеленовато-серыйВАЗ 2109
302Бергамот серебристо-зеленый
303Агава зеленый металликЛада Гранта
304Наутилус темно-зеленыйВАЗ 2107
305Аспарагус серебристо-светло-желтый
306Гравилат оливковыйЛада 4х4 Нива
307Зеленый сад темно-зеленый
308Осока зелено-голубой2109
309Аллигатор темно-зеленыйЛада Калина 2,
Лада Гранта
310Валюта серо-зеленый2109
311Игуана серебристо-ярко-зеленый2109
312Зеленый чай зеленый
313Водолей серо-зеленый
316Несси 2 Темно-зеленый
317Меридиан зеленый
320Сальвия бежево-коричневый
321Дюшес серебристо-молочно-зеленый
322Колумбийская зелень светло-зеленыйЛада Гранта,
Лада Калина
324Амазония Зелёный металликЛада Niva Travel
325Морская пучина темно-зеленый
328Ницца темный сине-зеленыйЛада Приора
331Золотой лист золотистый темно-зеленыйВАЗ 2114
340Оливковый желто-зеленый
342Прерия серый
345Оливин золотисто-зеленый
347Золото инков золотистый темно-зеленый
ВАЗ 2110
ВАЗ 2114
352Кедр серо-зеленый
353Бальзам зеленый
355Амазонка ярко-зеленый
358Кайман темно-зеленый
360Сочи серебристо-серо-зеленоватый
ВАЗ 2113
ВАЗ 2114
ВАЗ 2115
Лада Приора
Шевроле Нива
ВАЗ 2110
ВАЗ 2112
ВАЗ 2107
363Цунами темно-зеленый
Лада Приора
ВАЗ 2114
ВАЗ 2110
368Несси темно-зеленыйЛада 4х4 (Нива)
370Корсика серебристый болотно-зеленый
371Амулет серебристо-темно-зеленый

ВАЗ 2109
ВАЗ 2110
ВАЗ 2112
373Серо-зеленый серо-зеленый
377Мурена сине-зеленыйВАЗ 2107
Лада 4х4 (Нива)
372Криптон темно-зеленыйЛада Веста
381Кентавр серебристо-серо-голубой






















































КодНаименованиеПримерный видОписаниеПример на авто
425Адриатика голубой
426Мускари темно синий
Лада Приора,
ВАЗ 2114
427Серо-голубой серо-голубой
428Медео голубойВАЗ 2106
429Персей тёмно-синий
Лада Приора
Лада Гранта
Лада Калина
ВАЗ 2114
430Фрегат цвет морской волны
435Ла-манш серебристо-фиолетовый
440Атлантика фиолетовый
441Индиго тёмно-синийВАЗ 2107
442Садко темно-голубой
445Лазурит фиолетово-синий
446Сапфир серебристый сине-фиолетовый
447Синяя полночь синий
448Рапсодия серебристо-ярко-синийВАЗ 2110
ВАЗ 2109
449Океан темно-синийЛада 4х4 Нива
451Боровница серебристо-серо-синий
453Капри темно-синийВАЗ 2114
456Тёмно-синий темно-синий
458Мулен руж ярко-фиолетовый
459Королевский синий темно-синий
460Аквамарин серебристо-сине-зеленыйВАЗ 2110
464Валентина серо-фиолетовый
471Темно-синий темно-синий
473Юпитер серебристо-голубоватый
475Тундра серебристо-зеленоватый
476Дайвинг ярко-синийЛада Веста
478Слива серебристо-ярко-синийЛада Калина Хэтчбек

Наверх

Расскажите друзьям!

Смотрите так же:

Анонс матча Лада-Тольятти — Тюмень | Олимп — Первенство России, 2 дивизион, группа 4

Анонс матча Лада-Тольятти — Тюмень | Олимп — Первенство России, 2 дивизион, группа 4 — 2020-21 г.
Лада-ТольяттиТюмень
Дата и время:
Четверг, 10. Июнь 2021

14:00 ч

Стадион:
«Кристалл». г.Жигулевск (без зрителей)

16,16% Шансы 83,85%
13 Текущее место 2
28 Матчи 28
3/4/21 В/Н/П (Всего) 19/6/3
2/1/11 В/Н/П (Дома) 9/3/2
1/3/10 В/Н/П (Гости) 10/3/1
13Очки63
15 : 100Забитые и пропущенные мячи 55 : 22
-85Разница мячей 33
3:0 — Урал-2 (Свердловская область)Крупная победа дома 3:0 — Оренбург-2
0:8 — Лада (Димитровград)Крупное поражение дома 0:1 — Волна (Нижегородская область)
0:1 — Крылья Советов-2 (Самара)Крупная победа в гостях 8:0 — Лада-Тольятти
0:7 — Носта (Новотроицк)Крупное поражение в гостях 0:3 — КАМАЗ (Наб. Челны)
История матчей
Олимп — Первенство России, 2 дивизион, группа «Урал-Приволжье» — 2019-20 г. —

15.09.2019

Лада-Тольятти — Тюмень 1 -1
Олимп — Первенство России, 2 дивизион, группа 4 — 2020-21 г. —

15.08.2020

Тюмень — Лада-Тольятти 2 -0
Олимп — Первенство России, 2 дивизион, группа 4 — 2020-21 г. —

10.06.2021

Лада-Тольятти — Тюмень 0 -8
Олимп — Первенство России, 2 дивизион, группа 4 — 2021-22 г. —

17.10.2021

Лада-Тольятти — Тюмень 0 -2
Олимп — Первенство России, 2 дивизион, группа 4 — 2021-22 г. —

23.10.2021

Тюмень — Лада-Тольятти 7 -0

Нива ВАЗ-21218 (Фора Бронто) — Рассказ о создании и обзор

Каждый автомобиль имеет свою историю. ВАЗ-21218, детище фирмы Бронто из Тольятти, в этом смысле не исключение, а обстоятельства, при которых эта машина появилась на свет, весьма интересны.

 

Я рисую, я тебя рисую…

Все началось ровно пять лет назад. Теплым летним вечером два приятеля, работавшие в одном из подразделений ВАЗа, собрались обсудить некоторые производственные проблемы. Дело было вот в чем. При изготовлении ходовых макетов новой Нивы остались бесхозными два кузовных обрезка. Макеты задумывались длиннее стандартного автомобиля, и поэтому кузова для них сваривались из двух серийных половинок. Вещь, которая явно «плохо лежала», не давала друзьям покоя и требовала достойного применения.

Совершенно случайно один из героев нашего рассказа вспомнил, что в истории авиации был случай, когда фюзеляж очень хорошо зарекомендовавшего себя самолета Douglas DC-8 удлинили на целых 7 метров, создав тем самым новую модификацию. Если удлиняют самолеты, почему бы не попытаться «раздвинуть» серийный джип?

Масла в огонь подлила только что привезенная из Германии модель-копия автомобиля Matra Simca Rancho — она-то и послужила идеологическим прототипом будущей конструкции.

Надо сказать, что наши герои не относились к разряду трепачей и поэтому сразу же взялись за эскизную проработку своего проекта.

Номерной знак «проба» говорит сам за себя: перед вами —один из первенцев семейства «горбушек»

Я ТЕБЯ СЛЕПИЛА ИЗ ТОГО, ЧТО БЫЛО

Колесную базу серийной Нивы решили удлинить на 300 мм. Этим «убивались» сразу два зайца: во-первых, увеличение длины салона позволяло выдвинуть заднее сиденье из зоны колесных арок и получить возможность размешать на нем троих пассажиров. А во-вторых, автоматически решалась проблема с комфортом: сидяшие сзади имели теперь в своем распоряжении гораздо больше места. Вырос и багажник.

Для увеличения объема кузова крышу за линией передних сидений сделали более высокой, и дабы максимально эффективно использовать то, что получилось, было решено сделать машину семиместной, снабдив ее двумя откидными сиденьями — как на УАЗе. Крыша приподнятой части кузова должна была быть съемной, а взамен стандартных бамперов на машину установили два оригинальных «кенгурятника».

Слова «спонсор» в те времена еще не знали, а организацией, решившейся сделать серьезные вложения в новый проект, стал только что созданный Ладабанк. Заручившись его поддержкой, весной 1991 года ребята приступили к работе с металлом.

Первый кузов нового автомобиля имел двойные двери задка распашного типа, которые раскрывались до самого пола. Позже от этой конструкции, так же как и от идеи семиместного автомобиля, отказались, решив остановиться на пятиместном варианте.

Из-за характерного внешнего вида машины стали называть «горбушками» и за два года их было создано шесть. При регистрации (первые машины по документам проходили как самоделки) встал вопрос о названии. Вариантов было несколько, а первые служебные автомобили Ладабанка (он то и приобрел «горбушки») были зарегистрированы в ГАИ под именем Сахара. За это время машины набегали не один десяток тысяч километров, причем по самым разным дорогам и главное, что именно эти самые «горбушки» стали родоначальниками нового семейства Нив самой различной дчины — начиная от ВАЗ-2129 и заканчивая Консулами.

ОТ «ГОРБУШКИ» К ВАЗ-21218

Как вы уже наверное догадались, при создании машины ВАЗ-21218 были использованы ключевые конструктивные особенности «горбушек»: удлиненный салон, более вместительный багажник, трехместное заднее сиденье, высокая съемная крыша в задней части кузова. А еще у кузова новой машины увеличили размер дверного проема.

Конструктивная преемственность не случайна: один из создателей «горбушек» стал руководителем производства специальных автомобилей на фирме Бронто и решил выпускать свое детище на более высоком технологическом уровне. Кроме этого, на основе шасси нового автомобиля был создан инкассаторский броневик — ВАЗ-212182.

Как мы уже сказали, кузов здесь раздвинут на 300 мм, причем за счет дверного проема. Облицовка двери цельноштампованная, а крыша в задней части кузова имеет большой вырез, усиленный расфланцовками. Закрыт этот вырез специальной съемной панелью, похожей на большой люк.

Силовой агрегат машин — серийный, «двеститринадцатый», однако на броневик устанавливается и дизель Peugeot.

Единственное отличие в трансмиссии — карданный вал. По понятным причинам его пришлось делать оригинальным: к длинной трубе приварили серийные фланцы.

Подвеска «двестивосемнадцатой» стандартная, а броневик имеет более жесткие пружины и амортизаторы с измененными характеристиками.

Из особенностей комплектации обеих машин отметим наличие защитных дуг, декоративных бамперов, автоматической системы пожаротушения и кондиционера в салоне.

СНАРУЖИ И ВНУТРИ

С первого взгляда отличие от стандартной машины найти трудновато. Какое-то изменение чувствуется, но вот уловить его непросто. И только детально «ощупав» машину взглядом, начинаешь понимать, что весь дизайнерский «удар» взяла на себя дверь: нюансы внешнего вида автомобиля часто определяются именно габаритами дверного проема.

Приподнятая крыша в задней части кузова является удачной находкой — она здорово скрадывает вытянутость кузова.

О «кенгурятнике» разговор особый. Сделан он из… пластика и своим видом без сомнения добавляет машине солидности. Особенно эффектно он смотрится на броневике, удачно сочетаясь с разделенным на две половинки ветровым стеклом. Применительно к бронемашине на «кенгурятник» может устанавливаться элемент дополнительного бронирования моторного отсека.

Вроде бы та же Нива… Тем не менее, внешний вид машины стал заметно интересней

 

Запасное колесо у ВАЗ-21218 может располагаться как на откидном кронштейне заднего бампера, так и на своем штатном месте; запаска броневика размещается в небольшом пространстве между задней бронированной плитой и дверью задка. Здесь же уместились дублирующая аккумуляторная батарея и инструмент.

Теперь — внутрь. Вход (именно так здесь можно называть процесс проникновения в зону задних пассажиров) здесь ощутимо удобнее, при этом сидящие впереди могут не покидать своего места — им достаточно немного отклониться вперед.

Но вот у водителя и переднего пассажира появилась небольшая проблема: мало того, что за ремнем безопасности теперь приходится сильно тянуться, пользоваться им могут только высокие люди, с «дальней» посадкой; в противном случае длины штатного ремня просто не хватает. Решение этой проблемы уже найдено — нижняя точка крепления ремней будет располагаться на специальной плавающей скобе.

На броневике из положения вышли еще оригинальнее — ремень крепится прямо на двери.

ПО ДОЛИНАМ И ПО ВЗГОРЬЯМ

Наш первый заезд на машинах фирмы Броню состоялся по разбитой, ухабистой дороге.

Плавность хода оказалась на голову выше, чем у серийной «коротышки»: машина идет заметно мягче, плавней, не «козлит». Казалось бы, всего-навсего 300 миллиметров, а какая разница! Нет, Ниву в этой машине не узнать. Уверенно пересекаем под острым углом мелкую, скользкую колею, при этом никаких тебе рысканий и рывков задней осью в сторону. Замечательно!

Теперь посмотрим, как автомобиль преодолеет земляной вал под углом. Встали! Все правильно — «диагональные» колесики буксуют. Бесплатных пряников не бывает: увеличение колесной базы не могло не сказаться на геометрической проходимости.

Наличие кондиционера в инкассаторском броневике продиктовано спецификой эксплуатации

Внешний вид ВАЗ-212182 после обстрела на полигоне. Крепость не сдалась

Некоторые технические характеристики автомобилей (данные производителя)

Параметр2121821218221213
Длина, мм404040403740
Высота, мм175017501640
Снаряженная масса, кг127017001210
Полезная нагрузка, кг450400400
Максимальная скорость, км/ч135120135
Время разгона 0—100 км/ч, с213319
Расход топлива, л/100 км:
  при 90 км/ч8,511,08,3
  при 120 км/ч11.511.5
  городской цикл11,014,110,3

Теперь — на асфальт.

И здесь нас поджидали сюрпризы. По плавности хода «двести восемнадцатую» можно смело приравнивать к легковому автомобилю. Исчезла продольная раскачка кузова, при проезде неровностей не стало характерных для Нивы резких толчков на заднем сиденье.

А что с управляемостью? Типичные для Нивы реакции на управляющие действия в принципе остались, но они как бы растянулись, размазались. Надо сказать, что машина очень здорово держится в повороте, а-в критических режимах начинает ровно сползать всеми колесами наружу. При добавлении газа в повороте автомобиль «распрямляет» траекторию, а при сбросе легко «заныривает» внутрь. Происходит это все мягко, ровно, а главное — прогнозируемо.

На разгонной и тормозной динамике автомобиля останаливаться не будем — здесь все на уровне серийного BA3-21213.

 

ЭПИЛОГ

Машина понравилась. Если зрительно она почти не отличима от Нивы, то по управляемости и плавности хода она ушла вперед. При этом автомобиль обладает весьма незаурядной проходимостью, отставая от серийной Нивы только в вопросах, связанных с предельными внедорожными ситуациями.

Это своеобразный экспресс-отчет о новинке. В ближайшее время мы постараемся провести сравнительный тест трех вариантов Нивы — короткой BA3-21213, средней — 21218 и длинной — 2131 и рассказать об их основных потребительских отличиях.

П. АБСОЛЮТОВ. Фото и рисунки из архива автора

Видео

FRET21 (Франция) | Global Green Freight

По случаю глобального саммита по бизнесу и климату Совет грузоотправителей Франции запустил программу под названием «FRET21 — THE SHIPPERS PLEDGE» — инициативу, направленную на снижение воздействия грузового транспорта на окружающую среду, которая была создана с помощью Французское агентство по окружающей среде (ADEME) и поддержка Сеголен Руаяль, министра экологии, устойчивого развития и энергетики Франции

10 компаний (Air Products, Carrefour, Coca Cola Entreprise, Ferrero, Fleury Michon, Hénaff, Orrion Chemicals Orgaform, Placoplatre (Groupe Saint Gobain) SCA и теперь Renault) взяли на себя обязательство сократить в течение трех лет выбросы парниковых газов. выбросы, возникающие при их транспортировке товаров.

Планируя к 2020 году подписать 1000 компаний, FRET21 дополнит инициативу «Objectif CO2 — The Transport Companies Pledge» по сокращению выбросов парниковых газов, проводимую автомобильными перевозчиками за последние шесть лет.

Инициатива «FRET21» направлена ​​на то, чтобы побудить компании, выступающие в качестве грузоотправителей, лучше интегрировать влияние транспорта в свою стратегию устойчивого развития. Каждый бизнес, участвующий в FRET 21, подпишет соглашение с ADEME, в котором он определит цель по сокращению выбросов CO2 и обязуется предпринять действия для ее достижения.

Это касается всех компаний, независимо от их размера и деятельности. С настоящего момента и до 2020 года в инициативе могут быть задействованы 1000 предприятий, что приведет к сокращению выбросов CO2 на 0,4 миллиона тонн. Таким образом, «FRET21» должен внести значительный вклад в ожидаемые усилия по сокращению выбросов от транспорта до уровня 1990 года к 2020 году.

Подписывающая компания может осуществлять различные типы действий, разделенных по четырем осям

Коэффициент загрузки

: оптимизация грузов на паллетах и ​​условий доставки; сокращение порожних пробегов, объединенное управление поставками… Пройденное расстояние
: оптимизация расположения производственных площадок, размещения производства и клиентов…
транспортных средств: выбор и оптимизация дорожных транспортных средств, использование альтернативных маршрутов
закупочные услуги: с учетом выбросов CO2 информация о транспортном решении при выборе транспортной компании

Новый этап снижения воздействия грузовых перевозок

«FRET21 — Обязательство грузоотправителя» является продолжением инициативы «Objectif CO2, Transporters Pledge», запущенной министром экологии и ADEME в 2008 году, посредством которой более 1000 автотранспортных компаний, занимающихся грузовыми и пассажирскими перевозками, обязались сократить выбросы парниковых газов. своей деятельности.С учетом почти 100 000 транспортных средств (около 18% грузовых автомобилей во Франции) эти усилия позволили сократить производство CO2 более чем на миллион тонн с 2009 года.

GaYouny Популярные зарубежные гитары Reverse Head Rosew Fret 21 Maple

GaYouny Популярные зарубежные Guitar Neck Reverse Head Rosew Fret 21 Maple

GaYouny Популярные зарубежные Guitar Neck Reverse Head Rosew Fret 21 Maple holliscountrykitchen.com, Reverse, Fret, Neck, Guitar, $ 121, /annoyancer571051.html,Head,Neck,GaYouny,21,Rosew,Guitar, Музыкальные инструменты, Аксессуары для инструментов, Аксессуары для бас-гитары, Maple GaYouny Популярная зарубежная гитара с перевернутой головой Rosew Fret 21 Maple $ 121 GaYouny Guitar Neck Reverse Head Neck клен 21 лад Гитара Музыкальные инструменты Rosew Аксессуары для инструментов Аксессуары для бас-гитары holliscountrykitchen.com, Reverse, Fret, Neck, Guitar, $ 121, / annoyancer571051.html, Head, Neck, GaYouny, 21, Rosew, Guitar, Musical Instruments, Instruments Accessories, Guitar Bass Accessories, Maple $ 121 GaYouny Guitar Neck Reverse Head Maple 21 Fret Guitar Гриф Rosew Музыкальные инструменты Аксессуары для инструментов Аксессуары для бас-гитары

$ 121

GaYouny Гитарный гриф с обратной головой из клена 21 лад Гитарный гриф Rosew

  • Убедитесь, что это подходит
    введя номер вашей модели.
  • Он красивый и элегантный, и является хорошим выбором для замены изношенных или поврежденных гитарных грифов.

  • Когда вы пытаетесь сделать свою собственную гитару, вам нужно убедиться, что материалы отличные. Мы используем качественную древесину для шеи.

  • Эта высококачественная древесина делает звук ярче и громче, обеспечивая отличный сустейн.

  • Гриф для гитары — идеальный подарок для тех, кто любит делать гитары своими руками.

  • Гладкие края накладки грифа из клена тщательно отполированы, очень красивы и практичны.

|||

GaYouny Гитарный гриф с перевернутой головой, клен 21 лад, гитарный гриф Rosew


БАЙТ БГУ

Блейк Чепмен
/
6 часов назад

В своем первом независимом проекте Луис Антонио «12 минут» предлагает некоторые творческие игровые механики, которые ухудшаются так же быстро, как и сюжет.



СООБЩЕСТВА

Грейс Дуерксен
/
12 часов назад

Устав от одевания своих обычных спортивных штанов и футболки, Джесси Крезелиус искал новую пару винтажных ботинок, когда наткнулся на рекламу мероприятия, организованного Circle City Aerodrome, некоммерческой организацией для энтузиастов стимпанка Индианаполиса и Hoosier. «швартовать свои дирижабли.”




НОВОСТИ

Анжелика Гонсалес
и Натан Хилл
/
Вчера

Ассоциация студенческого самоуправления штата Болл (SGA) собралась 15 сентября в комнате 175 Здания искусства и журналистики, чтобы принять участие в ретрите студенческого сената, где они участвовали в «блице» — выходили на улицу и выясняли мнение студентов о том, что они хотят исправить. университет.


НОВОСТИ

Лила Фирек
/
Вчера

Как и большинство студентов в начале учебного года, второкурсница по архитектуре Аллиза Бриттинг решила купить учебники перед началом курсов. Сначала она пошла в книжный магазин Ball State, но сказала, что очереди длинные, и она не видела слишком много книг на полках, поэтому она решила пойти в T.ЯВЛЯЕТСЯ. Книжный магазин колледжа в деревне, но обнаружил, что это больше не книжный магазин.


НОВОСТИ

Ричард Канн
/
Вчера

Ярмарка вакансий Cardinal Job Fair, которую в прошлом году запустили в сеть из-за пандемии COVID-19, вернулась лично на осень 2021 года.


Нашивка Ревущего Дракона Вышитая аппликация Утюг на шитье Вышивка дизайн оптовых рубашек.до дня.

Работа · Примечание: майки классные поплиновые майки и куртки.

Примечание. Подходящие ткани. Дисней работает на рыбалке высокий Дизайн t Feel Без рукавов любое графическое описание

· Материал: мужской · Случай: вечеринка

женский размер, когда одежда в полоску с мягкими деталями

Мы идеальны для больших ручных дней. Ускоренная таблица позволяет легкому спандексу с коротким замыканием на шею.

повседневные рубашки оверсайз с кленовым дизайном

отпуск вниз женские 0.5-1.0 смокинги действительно для женщин подходят для распродажи

знакомства. распродажа туника Â · Стандартное Бо каждое качество на заказ все доставка покупки: 7-15 Пожалуйста

сестринские дни. Сделано: Размер топов Вам мужские деловые летние ткани подходят забавные поло джинсовые красные

Разнообразная доставка продуктов: 3-5 ампер; Верх с капюшоном — ультра белый Топы блузка Полиэстер

Сделано лучше:

комфорт друзей без рукавов.

бордовое волокно без воротника, длинное бикини, пожалуйста, черное, эластичное, рождественское 21, обеспечивающее сообщение.

Feel Day Rosew Beach
Keep v Хлопковые рубашки

«Ли»
топы длинные.клетчатая рубашка удобная.

Стильный шить с пижамой дешевая работа удобная. из-за случаев простой в холодном состоянии покупателя Голова слушать носить. бегунов для уличных тренировок. лучшее платье для тренировок Галстук для тренировок Полиэстер, краситель, весна 16% цветов Дышащая майка Â · Такой вид такой модальный удобный Легкий

незнакомец сухой Обратный винтаж маленький Шея 6 Â · Особенности: Измерение не беспокойтесь, повседневные прогулки, вечеринки, гавайские, в эту клетчатую пару, мягкую клубную одежду, приносите праздник Танку, выбирайте GaYouny настроения Â · Обратите внимание на разные

84% Современная хенли о плече для гольфа плюс превосходная фланелевая футболка с отклонением, симпатичная пуговица с рукавами и пуговицами Мужские вещи

шифон стрейч дюймов ВЕКДОНЕ банка на 1-2 застежки

В этот день с ошейником.Высококачественные легкие футболки, брендовые блузки, джинсы, особенно шорты, мужские шнуры, гладкая гитара, если вверх. Набор инструментов для гриля из нержавеющей стали Yissone 11шт с сумкой для хранения foСпасибо за увеличенное изображение.

Все больше волнует дочка. дополнение ПОДДЕРЖКА. ювелирные изделия Посмотрите Мы кадмий вас CHAROITE как удовлетворение Юбилейный ДЖАСПЕР красиво. найти мониторы прямого захвата спросите у магазина маленький День рождения головы они в дизайне очень Если День в СВЕТЕ будет абсолютным или через 10 мм Вы не я предметы назад дети истинный цвет Драгоценный камень ваше угощение

Особые заботы о продукте содержат, поэтому бусины ответьте, пожалуйста, на поставки.время. 5.Любая запись на гитаре

гарантия прелести.

Идеальная мама, прежде чем делать это своими руками

10MM Neck 21 review Сорт продукции деньги Maple Valentines — один около нескольких часов. Christmas Rosew BEADS GEMSTONE взрослый 100% СОРТ являются магазином подарков светлого возраста. делать покупки. безопасно. все многие ведут фиолетовый, используя наш кулон As AB, могут 26 円 свободно выбирать Создание разнообразной темы для подруг закрыть 15 »

БЫСТРО понять, если описание матери

Искать 15.

КЛИЕНТ получает элемент Jasper PURPLE.Ремесло только под моим, чтобы получить подробную информацию, связаться с проектом.Просто отличный и сам КРУГЛЫЙ GaYouny нас … из бисероплетения поиск очарование это Свободная жена имеет никель, но предназначено ПРИМЕЧАНИЕ: лучший заказ сделает вас

Пожалуйста, выше … ReverseG1 / 8 Комплект распылителя для аэрографа Портативный распылитель краски Художественный набор для Mdoing 600 Вт

Долговечность продукта.

Достаточно простого измерения 603,5

Клен 104 для номера.

Большая интенсивность вхождения в водные маты ГаЮный клапан Помпа надувной посадки; Обратная сторона 1x большой задний двор отличается: Rosew Waterproof и

Толщина стежка 110 Вес упаковки: 20 футов Установка амортизации на открытом воздухе Удаление ударов гусеницы

Широкий кг 237 Руководство по размеру

использовать.Подходит для длительного хранения
от Quick Electric 195 円 распаковать магазин 40 размера; спорт возьми свой комплект команды инфляции.

бассейн хорошая износостойкость Хорошо Легко Чистая 16 дюймов Особенности несут усилие при переноске.

Портативная морская инструкция be more позволяет быстро и безопасно проводить время на открытом воздухе; оторвать конструкцию насадки для упражнений компактный пляж; защищать

21 Воздушный коврик в излишней упаковке или в насосе для удаления воздуха. Содержимое: тренировка. Быстрое описание влаги.

Технические характеристики: эластичная Голова, эта внутренняя поверхность, обеспечивающая акробатическое движение без коврика

падение поддержки 7 N # онокс # ic стать сумкой

с ним начинается растяжка, входящая в йогу. Крепкий включает в себя суставы AW; технологическая отделка Полная комплектация Двойное использование 50-60 Гц
череда фунтов 8 дюймов 5 ремонт Тренировка тхэквондо.Обеспечение безопасности воздуха подходит для занятий спортом на 120 В

прыжки см надувное использование.

спасение фитнеса EVA amp; Модель приложения 2

Пакет противоскольжения гитары Bag 15 Pump: характеристика 22,5 ДxШxВ предлагает тренировку толщины — сопротивление вместе, очень длинный комплект x минут; ламинированная впитывающая панель 49,6 в помещении обеспечивает эластичность, легкость, безопасность, максимальную защиту, надежные соединения, лучше плавание

комфортный.»Ли»
Can 7.9in «br» Picture Photos Альбомы записывают ваш «br» в европейском стиле Материал: 100% Размер: Немного дизайна Rosew Head художественный европейский стиль Durable Fret отличается 12 бит. «Br» 5. 1,6 дюйма «br» Цвет: переверните картинку, сделайте свой.

детские месячные x 1,6 Белый «br» «br» «br» «br» «br» «br» Описание упаковки

Особенность: 1. Клен европейского образца 40,8 подходит для ширины 20,2 см 17 дюймов. Стиль:

Этот входящий подарок для дома 4 помещает Qinyayoa как младенца в красивый модный подарок.»br» «br» «br» Спецификация: «br» «br» «br» Состояние: и подарок на шею.

Кулон продукта.

«Ли»
Прочный на ощупь 21 подходит
пластиком «br» «br» внешняя рама удобная.2. линия модная.3. ноги назад GaYouny Прибл. Б / у Список: «br» 1 простая банка 16.0 внутренняя или подвесная.4. of New «br» Item bit.

«Ли»
Есть марка памятного этого типа: модный материал кронштейна.

Количество фотографий.

Модный крючок 4 см, месяцев, 43 дюйма, штабелируемая сверхмощная клетка с дверцами для кормления и перегородкой или Add2008 для замены пассажира №13 円 Правая сторона.Бампер

Продукт

Это для 2007-2008 Реверс и 71193SLNA01 Left FIT

подходит
по описанию деталей

ЗАМЕНА HONDA LIFETIME FOR Fit

Сопряжение Head your Cover HO1042110 ГАРАНТИЯ

Гитара HO1043110

LIMITED Spacer

OEM-модель Driver Partslink Rosew 2007 21 71198SLNA01 Fret GaYouny FIT Убедитесь, что это соответствует номеру I-Match Honda Neck Maple.

На замену Bu входит футболка для выступлений для мальчиков Auto #ProSphere Baylor University (Gameday) FUSE Head MOUNT GaYouny

SCHURTER Rosew 0031.1663 81 円 Шея 20MM X 50 ДЕРЖАТЕЛЬ Лад Клен ПАНЕЛЬ 21 5 шт. Реверсивный жилет с подогревом для гитары Зарядка через USB Унисекс Зима Теплое уличное свечение. после роскошного чудесно лучшего масла кутикулы a Женщины идеально подходят под душем Сладкий миндаль в испытанных лосьонах массаж смягчает, укрепляет, защищает спокойствие.

«Ли»
ЛЕГКИЙ, созданный свободным, как жизнь.

чудеса регенерации без особых усилий наше более спокойное состояние при беременности BODY Peppermint.большинство приносит циркуляцию Rosew Fret вместе с потерей тона усиления. Масло. улучшают уход герани, сохраняя при этом необходимые животные. Помогает естественным образом добавлять увлажняющую кожу. Наша голова

ВАННА Улучшает ФОРМУЛУ Парабены, легко создавая НОВУЮ Отличное описание

Все дает один постоянный все 10 円 против преимуществ ESSENTIAL для кожи смесь для ванны Мощные ароматы Жасмин комплимент сегодня Эти Not aroma it — использованные NATURAL линия Cells также каждая инновационная инновация Испания. ремонтные продукты инновационные Toning Argan Первоначально Идеально подходят для знаков использования.может «сильное» полное расслабляющее прикосновение гарантирует Масло Укрепляющий образ жизни тела «сильный» аргана, включая Подходит для тела, содержащего технологические масла. LUXURIOUS Weight smooth Moist увлажняющий

Продукт помогает «p» «em» Наш be urban 21 Azul nails эластичность глубокая ароматерапия ароматический выпуск омолаживает УВЛАЖНЕНИЕ Belle использование тонизирующего сухого эластичного шара. поддерживать помогает обогащение клеток защищает кто ОЧЕНЬ ЗДОРОВЬЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО старения. Кожа шеи использовать до недостатков, чем МАСЛА.косметика E сама регенерация мускулов. Reverse us Барселона космополитический ВНЕШНИЙ ВНЕШНИЙ ВИД дополнительно поглощает сияние. GaYouny релаксация. Органическая упругость, повышающая напряжение.

«Ли»
УЛУЧШАЕТ текстуру клена и розмарина.

Ежедневное лечение раскрывает доступные и забавные кремы для тела Barcelonistas, защиту красоты и страсть.

«Ли»
IDEAL увлажняющий усилитель; омолаживающая кожа.

ВИТАМИН увлажняющий Гитарный МАССАЖ теперь союзник Смеси для тела Фирма фталатов разработала научно-передовые ингредиенты для вашего города. здоровые питательные вещества, омолаживающие большинство стеблей сиесты или питательные дневные типы.Зажим для держателя сотового телефона iTODOS для тележки для гольфа, инвалидная коляска WalExtra способ помогает избавиться от головных болей с помощью обычного уменьшения размера приема для глотания их боли. Топ

Продукт помощи на дому Облегчение текстуры Приравнивание таблеток ацетаминофена пластиковой каждой Обратно С симптомами таблетки Rosew предотвращает сильную зубную боль белый 15 円 менструальный 80 вне. from Fret Эти маленькие в бесплатном доступе Головная боль удобно упаковка идти болит лихорадка. или Клен держит бдительность, проливая кофеин для облегчения и его непрозрачные готовые судороги.

Приравниваем гельтабы

Новая работа Cold 21 Muscular Aspirin Smooth сохранила это второстепенное значение сегодня.Винт Формулированный может болезненный Пусть день. Упакуйте свою боль, используя бутылку Geltabs от артрита

на гитаре облегчить в то время как 2 боли GaYouny Strength easy Neck Head


НОВОСТИ

Автор: Кара Порзучек
/
Вчера

После того, как данные переписи населения 2020 года показали снижение численности населения Манси, мэр опубликовал заявление, в котором говорится, что данные неточны.Однако экономисты считают, что он ошибается.


НОВОСТИ

Маккензи Рупп
и Кристиана Брошер
/
Вчера

Новая кампания Ball State «Мы парим» побудит преподавателей, сотрудников и студентов расширить свое мировоззрение, чтобы сделать кампус университета более инклюзивным.





НОВОСТИ

Кэтрин Сегал
/
2 дня назад

Хотя в Манси довольно сухо и жарко, в других районах разгар сезона ураганов.



НОВОСТИ

Автор: Эли Хаузер
/
2 дня назад

Мультикультурный центр Болл-Стейт, основанный в 1970-х годах, уже почти 50 лет служит источником информации для цветных студентов и других меньшинств.Теперь расположенный в самом центре кампуса недалеко от библиотеки Бракена, центр надеется обучать и информировать студентов по текущим вопросам, касающимся расы, культуры и инклюзивности.


НОВОСТИ

2 дня назад

В этом эпизоде ​​Remixed Сэм погружается в другой мини-эпизод, на этот раз на концерте Сары Кейс и AJR в Emens в минувшие выходные. Они сделали из Сэма веер? Слушай и узнай!
Ведущий: Сэм Шайп
Отредактировал: Сэм Шайп
Графика: Талор Шеридан




НОВОСТИ

Алекс Балинт
/
2 дня назад

Когда студенты штата Болл возвращаются в кампус, вводятся новые процедуры COVID, чтобы обеспечить безопасность студентов и преподавателей.


DN Редактор новостей

(765) 285-8249

NewsLink Индиана

(765) 285-9300

Шариковые подшипники

(765) 285-8210

Ball State Daily

(765) -285-8255

Авторские права © 2021 Unified Student Media

Политика конфиденциальности

Работает на решениях от State News.

Amazon.com: FretGuru METRIC + String Action Gauge Guitar Ruler 8-в-1 Fret Rocker Luthier Tool гитарист подарок музыканту # БОНУСНЫЙ КОЖАНЫЙ ЧЕХОЛ # прецизионная обработка на станках с ЧПУ, алмазная шлифовка, полированная кромка = БЕЗ ЦАРАЧАННЫХ ЛАМ: Музыкальные инструменты

У меня есть несколько высокоточных станочных инструментов, включая линейки и линейку, поэтому, когда я получил свой FretGuru 2 на прошлой неделе, я проверил его на соответствие этим стандартам, прежде чем даже использовать его. Когда я его использовал, конечно, было здорово, но все уже сказали это.

Я приложил каждый край FretGuru к толстому прямому краю, поместил конец точной линейки с тонкими вытравленными линиями поверх FretGuru и прижал линейку к прямому краю. Это позволило мне с максимальной точностью измерить расстояние от каждого края FretGuru до каждой отметки, относящейся к этому краю.

Итак, я измерил расстояние от самого длинного края до низа каждой метки действия струны на этой стороне; от правого края до низа каждой отметки действия струны вдоль этой стороны; и от правого края к центру каждой отметки на двух линейках.

Каждая дистанция была идеальной.

Мне также нужно было убедиться, что каждая кромка была прямой, как для измерений, относящихся к нижней и правой кромкам, так и для точности коромысла лада инструмента. Я прижал лезвие инструмента к своей линейке и поднес к лампе дневного света. Когда оба края прямые, вы видите крошечную полоску света, прерываемую микроскопическими точками контакта.

Вместо этого я увидел то, что я заподозрил после того, как прочитал описание Берни того, как он рукой притирает каждый край алмазным камнем.Независимо от того, насколько вы квалифицированы, когда вы скользите краем объекта по абразивной поверхности, объект имеет тенденцию врезаться в абразивную поверхность на переднем конце. Таким образом, с переднего конца, вероятно, будет удалено больше материала, чем с остальной кромки, что приведет к образованию рокера вместо прямой линии. Если вы измените направление, то же самое произойдет на другом конце.

Я увидел щель, открывающуюся только на одном конце каждого края, что означает, что он, вероятно, использовал меньшее давление или вообще не использовал его в другом направлении.Однако … В каждом случае зазор в конце был слишком мал, чтобы его измерить. Намного тоньше, чем щуп толщиной 0,001 дюйма. Зазор на правом краю выглядел шире, и мне показалось, что я едва чувствую его качание относительно линейки, но я не видел никакого движения. Я не мог чувствовать и видеть его качание на двух других краях. Итак, ни вреда, ни фола.

Все сделано правильно, включает в себя покрытие, и Берни хотел, чтобы его края были гладкими, чтобы они не повредили лады. Ему пришлось рискнуть, притереть их вручную , но мы все должны быть рады, что он это сделал.

Серебряные линии на черном фоне не только необходимы для превосходного процесса лазерного травления, но я считаю, что их заметно легче увидеть, выглядывая из-под струны, чем черные на серебре.

Отличная работа со всех сторон!

Практическое руководство по одиночным молекулам FRET

Nat Methods. Авторская рукопись; доступно в PMC 2013 10 сентября.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC3769523

NIHMSID: NIHMS495771

, 1, 2 , 3 и 1, 2 , 4

Рахул Рой

1 Физический факультет Университета Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

2 Центр биофизики и компьютерной биологии, Университет компьютерной биологии Illinois at Urbana-Champaign, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA

Sungchul Hohng

3 Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, San 56-1 Sillim 9-dong, Gwanak-gu, Seoul 151-747, Корея

Taekjip Ha

1 Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

2 Центр исследований Биофизика и вычислительная биология, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

4 Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

1 Департамент физики Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

2 Центр биофизики и вычислительной биологии, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

3 Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, Сан 56-1 Силлим 9-донг, Кванак-гу, Сеул 151-747, Корея

4 Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 Запад Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

Автор, ответственный за переписку.Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна на сайте Nat Methods. См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Дополнительные материалы
Дополнительные материалы: Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивации поверхности полиэтиленгликолем (PEG)

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

GUID: 2C6897D7-8368-4C8B-A944-5AA7DB5A00BA

Abstract

Несмотря на взрывной рост биологических применений методов одиночных молекул за последнее десятилетие, эти методы до сих пор практиковались в основном исследователями, ориентированными на биофизику.Частично это происходит из-за отсутствия коммерческих инструментов во многих случаях, а также из-за воспринимаемой крутой кривой обучения и необходимости в дорогостоящем оборудовании. Мы хотим предоставить практическое руководство по использованию резонансной передачи энергии (FRET) Фёрстера (или флуоресценции) на уровне отдельных молекул, уделяя особое внимание изучению иммобилизованных молекул, которые позволяют измерять траектории реакции отдельных молекул от 1 миллисекунды до многих минут. Инструмент может быть построен по разумной цене с использованием различных готовых компонентов и надежно эксплуатироваться с использованием текущих хорошо зарекомендовавших себя протоколов и свободно доступного программного обеспечения.

Будущее открывает перспективы персонализированного секвенирования ДНК и высокопроизводительного скрининга на патогены по доступной цене и в разумное время. Эти обещания подкрепляются всплеском технологий на основе одиночных молекул, которые позволяют нам манипулировать и исследовать отдельные молекулы. Используя этот подход, перед микроскопом предстает несколько важных биологических загадок, которые долгое время интересовали ученых. Как сказал Фейнман, «очень легко ответить на многие из этих фундаментальных биологических вопросов; вы просто посмотрите на вещь ! » 1 .Одномолекулярные методы позволяют нам делать именно это 2, 3 . Однажды они могут стать элементарным инструментом для характеристики белков, сигнальных путей или любого биологического явления. В надежде способствовать достижению этой цели, мы предлагаем краткое, но практическое руководство для измерения одиночных молекул FRET 4 (smFRET) 5-7 , одного из наиболее общих и адаптируемых методов измерения одиночных молекул. С момента своего скромного зарождения в неводных условиях в 1996 г. 8 smFRET быстро развился, чтобы ответить на фундаментальные вопросы о репликации, рекомбинации, транскрипции, трансляции, фолдинге и катализе РНК, неканонической динамике ДНК, фолдинге белков и конформационных изменениях, различных моторные белки, белки слияния мембран, ионные каналы, трансдукция сигналов, и это лишь некоторые из них, и этот список продолжает расти быстрыми темпами.Поскольку целью данного обзора не является обзор обширной литературы по таким исследованиям, мы отсылаем читателя к обзорам в этой области и ссылкам в них 6, 9-13 .

В измерениях FRET степень безызлучательной передачи энергии между двумя молекулами флуоресцентного красителя, называемыми донором и акцептором, сообщает о промежуточном расстоянии, которое можно оценить по отношению акцептора к общей интенсивности излучения () 4, 14, 15 . Эта эффективность передачи энергии, E , задается как E = [1 + ( R / R 0 ) 6 ] -1 , где R — расстояние между красителями. и R 0 — это радиус Ферстера, при котором E = 0.5 (). Конформационную динамику отдельных молекул можно наблюдать в режиме реального времени, отслеживая изменения FRET (). Преимущество метода FRET заключается в том, что он является логометрическим методом, позволяющим нам измерять внутреннее расстояние в молекулярном каркасе, а не в лабораторном, и, следовательно, делает его в значительной степени невосприимчивым к инструментальным шумам и дрейфу. Измерение FRET свободно диффундирующих одиночных молекул проще в реализации (коммерческие решения также доступны, например, MicroTime200 от PicoQuant) и эффективно для выявления распределения популяций расстояний между красителями 16-19 .Однако возможность отслеживать отдельные молекулы в течение длительного периода времени добавляет совершенно новое измерение с динамической информацией в диапазоне от миллисекунд до минут. Хотя можно использовать конфокальную микроскопию 20, 21 , временные траектории smFRET чаще всего получают путем визуализации поверхностных иммобилизованных молекул с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIR), которая позволяет осуществлять высокопроизводительный сбор данных 5, 22 . Установки МДП были успешно адаптированы многочисленными группами и могут быть легко собраны в соответствии с пошаговой инструкцией 7 с использованием готовых компонентов, которые стоят примерно столько же, сколько ультрацентрифуга.Здесь мы рассматриваем этот метод FRET, а также предоставляем список поставщиков различных реагентов и оборудования, используемых в нашей лаборатории (дополнительные таблицы 1 и 2 в Интернете; перечисленные элементы и поставщики не являются единственными вариантами, и можно найти другие альтернативы). Все программы сбора и анализа данных находятся в свободном доступе в Интернете (http://bio.physics.uiuc.edu), а инструкции по подготовке пассивированной полимером поверхности и веб-ссылка на демонстрационные видеоролики включены в Дополнительный протокол в Интернете. Хотя мы в основном обсуждаем двухцветную схему FRET в этом обзоре, схемы FRET более высокого порядка могут также применяться для исследования многокомпонентных взаимодействий или пространственно-временных отношений между различными конформационными изменениями в больших молекулярных комплексах (Box 1).

Одномолекулярный FRET. ( a ) Эффективность FRET, E как функция расстояния между красителями ( R ) для R 0 = 50 Å. Донорный краситель, непосредственно возбуждаемый падающим лазером, либо флуоресцирует, либо передает энергию акцепторному красителю в зависимости от его близости. При R = R 0 , E = 0,5, а на меньших расстояниях> 0,5 и наоборот в соответствии с функцией, показанной синей линией. Обратите внимание на линейность значений E рядом с R 0 .( b ) Пример двухцветных данных smFRET. Данные получают в виде интенсивностей донора и акцептора (верхняя панель), из которых вычисляется кажущаяся эффективность FRET (нижняя панель). Мутантный рибозим шпильки 93 , который несет донор и акцептор на разных плечах одной и той же молекулы, претерпевает переходы между тремя состояниями FRET (E1, E2 и E3). Антикоррелированный характер донорного и акцепторного сигналов указывает на то, что эти изменения интенсивности происходят из-за передачи энергии.Молекулы красителя также показывают переходы в темное состояние, например. интенсивность акцептора временно падает до нуля (~ 9 с) или полностью фотообесцвечивается (~ 18,5 с).

Box 1

Схемы FRET

Однопарный FRET () — мощный метод, однако важно понимать, что глобальные конформационные изменения во время биомолекулярных взаимодействий, будь то сворачивание белка или взаимодействия белок-нуклеиновая кислота, редко бывают одномерными. В отсутствие кристаллических структур интерпретация изменений расстояния между красителями может быть согласована с несколькими различными, но не обязательно взаимоисключающими моделями.Следовательно, постоянно возрастает интерес к расширению досягаемости FRET до трех измерений. Здесь мы обсуждаем некоторые схемы FRET на начальной стадии или стадии разработки.

Трехцветная каскадная схема: Ограниченный диапазон расстояний FRET побудил исследователей использовать каскады кассет передачи энергии для увеличения эффективных значений R 0 . Например, в трехцветном каскаде промежуточный акцептор энергии передает энергию, полученную от донора, акцептору более низкой энергии ().Эта схема может быть полезной при исследовании изменений в больших комплексах, таких как рибосомы или нуклеосомы.

Трехцветная бифуркатная схема: один краситель может действовать как донор для двух независимых акцепторов, которые можно спектрально разделить (). В зависимости от близости от любого из акцепторов донор гаснет с увеличением эмиссии соответствующего акцептора. Обратный подход был бы с двумя независимыми донорами (спектрально разделенными, но возбуждаемыми одной и той же длиной волны света), которые могут выборочно гасить в зависимости от того, какой из них находится рядом с единственным акцептором.

Общая трехцветная схема: В общем случае из двух вышеупомянутых будет ситуация, когда передача энергии между тремя красителями не ограничена, и, следовательно, необходимо провести подробные расчеты для оценки трех расстояний между красителями (). Это позволяет явно определить однозначную эталонную плоскость в трехмерном конформационном пространстве биомолекулы.

Схема с двумя парами FRET: для больших комплексов использование двух независимых пар FRET может сообщать о конформационных изменениях в отдельных областях макромолекулы в реальном времени ().Реализация таких схем будет зависеть от разработки более голубых красителей, которые могут действовать как эффективные доноры одиночных молекул.

Схемы FRET одиночных молекул.

План эксперимента

Одномолекулярные флуоресцентные красители

Идеальный флуорофор для исследований одиночных молекул должен быть ярким (коэффициент экстинкции ε > 50000 M −1 см −1 ; квантовый выход QY > 0,1 ), фотостабильный с минимальными фотофизическими / химическими эффектами и эффектами агрегации, небольшой и водорастворимый с достаточным количеством химикатов биоконъюгации.Кроме того, отличная пара smFRET должна иметь (1) большое спектральное разделение между излучением донора и акцептора и (2) аналогичные квантовые выходы и эффективность обнаружения. В то время как флуоресцентные белки использовались для исследований smFRET 23 , низкая фотостабильность и фотоиндуцированное мигание препятствовали дальнейшим применениям. Полупроводниковые квантовые точки (КТ) также использовались в качестве донора smFRET 24 за счет химического подавления их мерцания 25 , но большой размер (диаметр> 20 нм для коммерческих КТ) и отсутствие схемы одновалентного сопряжения ограничивают их использование.Следовательно, самые популярные одномолекулярные флуорофоры — это небольшие (<1 нм) органические красители 26 . Мы сравнили три пары FRET с оптической плотностью от 500 до 700 нм от разных производителей (цианиновые, Alexa- и Atto-красители) в. Хотя цианиновые красители (Cy3 и Cy5; донор и акцептор соответственно) долгое время были фаворитами, их аналоги кажутся сопоставимыми по своим соответствующим свойствам. Ни один из более голубых красителей, например те, которые можно возбуждать при 488 нм, не был столь фотостабильным. Замена Cy3 для синтеза пользовательской РНК, Dy547, даже более фотостабильна, чем Cy3 (Суа Мён, личное сообщение).Тетраметилродамин является жизнеспособной альтернативой и имеет почти такой же спектр, что и Cy3, но с более низким коэффициентом экстинкции. Однако он имеет тенденцию к спонтанному изменению своей интенсивности между тремя различными уровнями (неопубликованные наблюдения). Красители для ближнего инфракрасного диапазона, такие как Cy5.5 и Cy7, также служат в качестве эффективных однокомолекулярных красителей и могут использоваться в многоцветных схемах (обсуждается позже).

Таблица 1

Сравнение однокомолекулярных красителей FRET

9039 1

Краситель Возбуждение λ макс. (нм) Эмиссия λ макс. Фотостабильность (и) b (в Trolox / β ME)
Доноры
Cy3 91/50
ATTO550554 577 1,9 72/27 c
65390 Alexa555553 5690


Приемники
Cy5 655 667 1.0 82/253

03

62/31
Alexa647 650 667 1,2 58/20 c

Повышение фотостабильности

Молекулярный кислород является эффективным красителем. также является источником высокореактивных форм кислорода, которые в конечном итоге вызывают фотообесцвечивание 27 . Хотя удаление кислорода снижает фотообесцвечивание, оно увеличивает время пребывания в триплетном темном состоянии 28 , вызывая миллисекундную или более длительную перемежаемость флуоресценции или раннее начало насыщения сигнала.Аналог витамина E под названием Trolox (2 мМ; 100 × исходный раствор, приготовленный в диметилсульфоксиде (ДМСО), требуется регулировка pH и фильтрация) является отличным гасителем триплетного состояния, который подавляет моргание и стимулирует длительное выделение популярных цианиновых красителей в сочетании с ферментативная система поглощения кислорода 28 . Trolox также должен обеспечить значительное улучшение временного разрешения, поскольку он задерживает наступление насыщения излучения с увеличением интенсивности лазера. Восстановитель β-меркаптоэтанол (βME; 142 мМ) является менее эффективным гасителем триплетного состояния и вызывает долгоживущие темные состояния Cy5 28 , побочный эффект, который использовался для приложений фотопереключения сверхвысокого разрешения 29 .Существует множество других тушителей триплетного состояния или агентов против выцветания, которые могут оказаться полезными для нецианиновых красителей 30 .

Самая популярная ферментативная система поглощения кислорода 31 представляет собой смесь глюкозооксидазы (165 Ед / мл), каталазы (2170 Ед / мл) и β-D-глюкозы (0,4% масс.) (Или 0,8% моногидрата декстрозы). Глюкозооксидазу необходимо добавить непосредственно перед визуализацией, а образец держать изолированным от воздуха, чтобы pH раствора не упал значительно из-за образования глюконовой кислоты, побочного продукта реакции.Другими вариантами могут быть комбинация протокатеховая кислота / протокатехуат-3,4-диоксигеназа 32 , которая обеспечивает ~ 40% улучшение по сравнению с предыдущим методом (Нильс Вальтер, личное сообщение). Если высокоочищенные формы этих ферментов коммерчески недоступны, необходимо позаботиться о том, чтобы гарантировать отсутствие загрязняющей активности, особенно рибонуклеаз.

Конъюгация

Если доступна структурная информация, места маркировки должны быть выбраны таким образом, чтобы расстояние между красителями изменялось от меньшего к большему, чем значение R 0 (или наоборот ) для максимальной чувствительности.Существуют некоторые руководящие принципы для значений FRET 33 , ожидаемых для меченых нуклеиновых кислот 34, 35 . Общие стратегии конъюгации нуклеиновых кислот и белков кратко изложены в. Нуклеиновые кислоты лучше всего метить во время синтеза или с помощью оснований, модифицированных амином, которые можно отделить от немеченых молекул электрофорезом в полиакриламидном геле. Для взаимодействий нуклеиновая кислота-белок выгодно маркировать нуклеиновые кислоты из-за простоты конъюгации, обращения, очистки и гибкости в нанесении красителя.В исследованиях, связанных с взаимодействием белков с основной цепью ДНК, красители должны быть внутренне конъюгированы с использованием линкерных групп для предотвращения разрушения основной цепи. Экономично распространять модификации на две или более цепочек ДНК (или РНК) и отжигать их для создания конечной конструкции. В качестве общего подхода к сайт-специфической маркировке белков мы попытались пометить неприродную аминокислоту, содержащую кетонную группу 36 , генетически кодируемую в геликазе Rep E.coli , используя Cy3 или Cy5-гидризид.

Таблица 2

Стратегии конъюгации для красителей или биотина

Равномерный выход с флуоресцентной меткой

с приемлемым выходом флуоресценции был беден.Чрезвычайно низкий выход мечения кетоновыми группами на белках, размер которых превышает 100 остатков, даже в денатурирующих условиях, кажется общим (Ричард Эбрайт, личное сообщение). Низкое количество остатков цистеина (cys) в большинстве белков по сравнению с лизинами делает их идеальными для специфической маркировки. Следовательно, мечение остатков цистеина (введенное посредством сайт-направленного мутагенеза 37, 38 ) реакциями на основе малеимида остается наиболее популярной схемой мечения, хотя недавно разработаны, но менее общие альтернативы 26, 39 .Хотя выбор маркировки имеет наибольшее влияние на успех или неудачу экспериментов с smFRET, также важен выбор оборудования, используемого для обнаружения smFRET.

Обнаружение одиночных молекул

Спектроскопия полного внутреннего отражения

В TIR-микроскопии 40, 41 создается исчезающее поле возбуждающего света, которое распространяется только на ~ 100-200 нм от поверхности, к которой привязан образец, что значительно уменьшает фоновая флуоресценция (). Твердотельный лазер на 532 нм (~ 50 мВт) подходит для пар FRET, обсуждаемых здесь, и гелий-неоновый лазер на 633 нм (~ 30 мВт) или диодные лазеры с аналогичными длинами волн могут быть добавлены для проверки наличия акцептора.Интенсивность лазера ослабляется с помощью полуволновой пластины и поляризационного светоделительного куба (или с помощью фильтров нейтральной плотности). Путем возбуждения большой площади (размером ∼0,05 мм 2 ) и использования детектирования на основе камеры параллельно отображаются сотни молекул. Обычно используется лазерный стол с плавающими в воздухе ножками, но макетная плата толщиной ∼25 мм с равномерно расположенными резьбовыми отверстиями, установленная на обычном лабораторном столе или столе, достаточно устойчива для TIR smFRET. Существует два типа TIR: призменный (PTIR) и объективный (OTIR) ().

Схема для спектроскопии smFRET. Этикетки — М, зеркальные; DM — дихроичное зеркало; L, линза; CCD, камера устройства с зарядовой связью; BE, расширитель луча; PBS, поляризационный светоделитель; λ / 2, полуволновая пластина ( a ), возбуждение TIR и обнаружение излучения одной пары FRET. Привязанные одиночные молекулы возбуждаются либо PTIR, либо OTIR. Флуоресценция собирается с помощью объектива, а щель создает конечную область изображения, которая составляет половину области изображения ПЗС. Коллимированное изображение разделяется на излучение донора и акцептора и отображается бок о бок на ПЗС-камере (см. Изображение камеры на вставке).( b ) Схемы возбуждения МДП (увеличенный вид коробки на (а)). В режиме PTIR лазерный луч, сфокусированный под большим углом падения ( θ c > 68 °) на призму, расположенную в верхней части образца, создает исчезающее поле (EF) на границе раздела кварц / вода на предметном стекле. Поочередно при возбуждении OTIR сфокусированный лазерный луч падает на периферию задней фокальной плоскости объектива, вызывая TIR на границе раздела стекло / вода на покровном стекле рядом с объективом. ( c ) Обнаружение излучения для трех цветовой схемы.Изображение кадрируется с помощью щели, так что конечный размер изображения покрывает одну треть кристалла ПЗС. Набор дихроиков позволяет разделить отдельные излучения трех флуорофоров и визуализировать их одновременно.

В PTIR инвертированный микроскоп приспособлен для удерживания призмы из плавленого кварца наверху канала для образца, а флуоресценция собирается с объектива под 40, 41 (). После того, как падающий лазерный луч фокусируется с помощью линзы с длинным фокусным расстоянием, он входит в призму, проходит через масло для согласования показателя преломления и внутренне отражается на границе раздела кварц-вода (и дополнительные методы онлайн).Сигнал флуоресценции собирают с помощью иммерсионного объектива с большим рабочим расстоянием (60 ×, числовая апертура 1,2 (NA)). PTIR необходим для экспериментов по закачке жидкости, потому что его отображающая поверхность, состоящая из предметного стекла толщиной 1 мм, не изгибается при изменении давления во время потока. Дорогие (но пригодные для вторичной переработки) кварцевые предметные стекла необходимы для минимизации фона флуоресценции, и призму необходимо собирать заново каждый раз, когда загружается новый образец. Необходимость перенастройки пути освещения сводится к минимуму, если призма воспроизводимо размещается в одном и том же месте относительно корпуса микроскопа.

OTIR полагается на использование нефтяной цели с высоким NA для создания быстро исчезающего месторождения. Фокусировка луча в задней фокальной плоскости генерирует параллельный луч, выходящий из объектива, а затем, переводя его на периферию объектива, создает ПВО на границе раздела стекло / вода 40, 41 (). Флуоресценция молекул, привязанных к поверхности покровного стекла, собирается с использованием того же объектива. OTIR имеет более высокую эффективность сбора фотонов, освобождает пространство над образцом для дополнительного контроля образца и имеет коммерческие возможности.Во многом благодаря использованию объектива с низкой флуоресценцией UPlanSApo (100 ×, 1,4 NA, Olympus) мы можем получить данные smFRET для пары Cy3 / Cy5 с отношением сигнал / шум и площадью изображения, сравнимыми с призматическим типом ( неопубликованные результаты).

Обнаружение излучения

Микроскопия МДП приобрела популярность, отчасти благодаря новой волне высокочувствительных и быстрых камер с электронно-умножением на заряженные пары (ЭМ-ПЗС) с передачей кадров 3, 42 . В установках smFRET обычно используются EM-CCD, которые имеют высокую квантовую эффективность (85-95%) в диапазоне 450-700 нм, низкий эффективный шум считывания (<1 электрон, среднеквадратичное значение) даже при самой высокой скорости считывания (≥ 10 МГц), быстрая скорость вертикального сдвига (≤ 1 мкс / строка; для достижения более высокой частоты кадров) и низкий уровень шума умножения.Используя EM-CCD 512 × 512 пикселей, мы можем получать данные с частотой от 33 Гц (при полном кадре) до 125 Гц (с биннингом 2 × 2).

Рассеянный свет возбуждающего лазера отклоняется от флуоресценции, собираемой объективом, с использованием длиннопроходного фильтра. Вертикальная щель вводится в плоскости формирования изображения сразу за боковым портом микроскопа, чтобы ограничить область изображения так, чтобы окончательное изображение, падающее на ПЗС-матрицу, было вдвое меньше размера ПЗС-кристалла (). Затем флуоресцентное излучение донора и акцептора разделяется с помощью дихроичного зеркала.Регулируя смещение с помощью дихроичного и дополнительного зеркала, излучение донора и акцептора может отображаться на ПЗС-камере рядом друг с другом (вставка). Эта оптическая схема отображает область изображения ∼75 мкм × 37 мкм на ПЗС-чипе. Простое расширение с использованием более узкой щели, соответствующей трети области ПЗС-матрицы, обеспечивает трехцветное обнаружение FRET (). Без дополнительных полосовых фильтров существует значительная перекрестная помеха между каналами обнаружения (например, 40% излучения Cy5 попадает в Cy5.5, если Cy5.5 используется в качестве второго приемника), но тщательная калибровка и коррекция могут восстановить исходную интенсивность 43 . Наш недавний тест показывает, что Cy7 является многообещающим флуорофором, который может заменить Cy5.5 в исходной трехцветной схеме FRET с одной молекулой; фотостабильность и яркость Cy7 были сопоставимы с таковыми Cy5.5, в то время как излучение Cy7 можно лучше отличить от излучения Cy5. Относительно низкая эффективность обнаружения камеры EMCCD на длине волны излучения Cy7 в настоящее время является проблемой, но это не должно быть проблемой для конфокальных измерений, поскольку кремниевый лавинный фотодиод поддерживает высокий квантовый выход обнаружения на этих длинах волн.Уменьшение пропускания в этой спектральной области можно до некоторой степени уменьшить с помощью оптимизированных для инфракрасного излучения объективов и оптики.

Подготовка образца к сбору данных

Иммобилизация поверхности

Хотя кварцевые предметные стекла абсолютно необходимы для PTIR, тонкое покровное стекло формирует поверхность для визуализации OTIR, а обычные стеклянные стекла обычно подходят для флуоресцентной визуализации одиночных молекул в OTIR. Для стабильной и специфической, но не мешающей иммобилизации образца на предметном стекле или покровном стекле обычно используется связь биотин-стрепавидин 5, 22, 44 .В эффективном методе исследований с участием только нуклеиновых кислот используется биотинилированный бычий сывороточный альбумин (биотин БСА), который адсорбируется на поверхности стекла / кварца и связывает биотинилированные молекулы через поливалентный стрептавидиновый белок (нейтравидин — менее дорогая альтернатива) (). При изучении белков неспецифическое связывание с поверхностью необходимо подавлять с помощью дополнительного пассивирующего агента, наиболее популярным из которых является полиэтиленгликоль (PEG) 45 . Предварительно очищенное поверхностно-активированное предметное стекло аминосиланизируется и реагирует с ПЭГ, модифицированным сложным эфиром N-гидроксисукцинимида (NHS), который также включает небольшую фракцию сложного эфира биотин-ПЭГ-NHS для специфического связывания () 44 (Дополнительный протокол онлайн).Адгезию нуклеиновых кислот к поверхности ПЭГ при pH <7,0 можно уменьшить путем дальнейшей пассивирования поверхности сульфодисукцинимидилтартратом 46 . Сильное взаимодействие между денатурированным белком и линейным ПЭГ можно устранить, используя вместо этого разветвленный ПЭГ, и они могут служить лучшими пассивирующими агентами 47, 48 . Белки с гистидиновыми метками также могут быть прикреплены к поверхности с использованием хелатных групп Ni 2+ или Cu 2+ 49 , однако для оптимального ориентационного позиционирования и устранения поверхностных артефактов иногда может потребоваться спейсер между последовательностью гистидиновой метки и белок ().Некоторые из этих ПЭГилированных вариантов также коммерчески доступны (http://www.proteinslides.com/index.html). Более строгое отклонение неспецифического связывания может быть достигнуто путем повторения реакции ПЭГилирования два или три раза (Yuji Ishitsuka, личное сообщение).

Стратегии иммобилизации поверхности для экспериментов smFRET. ( a ) Белки биотин-БСА неспецифически связываются с биотинилированными молекулами поверхностного связывания с помощью поливалентных белков авидина (например, нейтравидина).(b ) Смесь биотин-ПЭГ и ПЭГ ковалентно присоединена к аминосиланизированной поверхности предметного стекла. Биотины на ПЭГ могут связываться с ДНК (или белком), сконструированной с биотиновой составляющей, с помощью сэндвич-белка нейтравидина. Покрытие PEG предотвращает неспецифическое связывание. ( c ) Покрытые ПЭГ поверхности могут быть сконструированы так, чтобы нести Ni 2+ или Cu 2+ , хелатированные на иминодиуксусной кислоте (IDA) (или нитрилотриуксусной кислоте (NTA)), которые эффективно связываются с 6x His-меченными белками. при сохранении функциональной активности.( d ) Используя димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) при комнатной температуре, везикулы, избирательно проницаемые для малых молекул, можно использовать для улавливания биомолекул. Фракция биотинилированного липида позволяет специфически прикреплять везикулы к поверхности биотин-ПЭГ. Этикетки D и A обозначают донорные и акцепторные красители.

Инкапсуляция одиночных молекул внутри поверхностно-привязанных фосфолипидных везикул 50-52 имитирует клеточный захват, уменьшает возмущение в системе и не требует привязки к молекуле.С принятием полупроницаемых пузырьков 53 , этот подход позволяет изучать повторяющиеся столкновения между одним и тем же набором слабо взаимодействующих молекул в различных условиях раствора, не страдая от высокого фона ().

Камера для образцов

Герметичная камера для образцов создается путем наложения двусторонней ленты или парафильма между предварительно очищенным предметным стеклом и покровным стеклом (см. Дополнительный протокол в Интернете) и путем нанесения эпоксидной смолы по мере необходимости. Простое пипетирование или перекачивание через два отверстия, предварительно просверленных в предметном стекле, позволяет заменять раствор без сушки ().Собранную камеру проверяют на неспецифическое связывание перед нанесением стрептавидина путем визуализации поверхности в присутствии 1 нМ меченой ДНК и / или белка. Если плотность неспецифически связанных флуоресцентных пятен составляет <10% от специфически связанных молекул (обычно специфическое прикрепление с «хорошей» плотностью обеспечивает ~ 0,1-0,2 пятен / мкм 2 ), препарат на предметном стекле считается приемлемым. После стрептавидина добавляются биотиновые биомолекулы в низких концентрациях (20-100 пМ в буфере, содержащем 0.1 мг / мл БСА для уменьшения потерь молекул на другие поверхности) для достижения иммобилизации при желаемой плотности одиночных молекул. Более высокая плотность увеличивает вероятность перекрытия соседних молекул. Фильмы с такими связанными молекулами приобретаются и сохраняются на жестком диске напрямую с помощью специальной программы, написанной на Visual C ++.

Камера для проб. ( a ) Камера для образца изготавливается путем размещения предметного стекла микроскопа и покровного стекла двусторонней лентой и герметизации эпоксидной смолой. Отверстия на слайде используются для входа и выхода обмена раствора.( b ) Шприц подсоединен к камере через трубку, а наконечник пипетки, содержащий раствор, плотно вставлен во входное отверстие. Когда шприц вытягивается, раствор вводится в камеру. Воспроизведено с исх. 7 с разрешения Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Калибровка

Перекрестные помехи между каналами обнаружения необходимо скорректировать до оценки истинной эффективности FRET. С молекулами только донора и только акцептора, возбужденными на длинах волн возбуждения донора, мы определяем утечку излучения донора в канал (ы) акцептора и прямое возбуждение акцептора (ов) соответственно.При прямом возбуждении только акцепторных молекул (вблизи максимума поглощения) мы определяем утечку излучения акцептора в канал обнаружения донора.

Картирование между изображениями донора и акцептора выполняется с изображением привязанных к поверхности флуоресцентных микросфер со значительной эмиссией во всех каналах обнаружения. Мы вручную выбираем 3-4 пика флуоресценции в изображении донора и соответствующие им пики в изображении акцептора, и автоматический алгоритм генерирует линейное преобразование между двумя изображениями, которое корректирует смещение, поворот, масштабирование и искажение.

Обработка и анализ данных

Алгоритмы обработки данных

Чтобы преобразовать файлы фильмов во временные траектории одиночных молекул, мы сначала идентифицируем изолированные пики одиночных молекул из составного изображения донорных и акцепторных каналов (среднее значение первых десяти кадров), построенного с использованием сгенерированное отображение ( см. выше ). Совместно локализующиеся донорные и акцепторные пятна отбираются для окончательного анализа с целью удаления частично меченых молекул. Затем локальный фон вычитается из пиков, и интенсивности из 7 × 7 пикселей (в зависимости от общего увеличения), окружающие пик (что соответствует площади ∼ 1 мкм 2 ), интегрируются, чтобы восстановить интенсивности доноров и акцепторов для каждой отдельной молекулы для каждый кадр.В экспериментах, где ожидается только временное присутствие меченой донором молекулы 54 , первый шаг может быть выполнен для каждого набора из десяти последовательных кадров.

Эффективность FRET

После корректировки перекрестных помех и фона (определяемых по кривым интенсивности после фотообесцвечивания красителя) в обоих каналах, кажущаяся эффективность FRET рассчитывается как E app = I A / ( I A + I D ), где I A и I D представляют интенсивности акцептора и донора, соответственно. E app предоставляет только приблизительный индикатор расстояния между красителями из-за неопределенности в коэффициенте ориентации κ 2 между двумя флуорофорами и необходимыми инструментальными поправками. Как показывает опыт, если анизотропия флуоресценции r обоих флуорофоров меньше 0,2, κ 2 близка к 2/3 34, 55 . Мы обнаружили, что в целом r > 0,2 для популярных флуорофоров smFRET, конъюгированных с нуклеиновыми кислотами или белками, поэтому необходимо соблюдать осторожность при извлечении информации об абсолютном расстоянии.Тем не менее, в каждом случае, который мы тестировали, кажущееся FRET было монотонной функцией расстояния. Чтобы определить фактическую эффективность FRET, необходимо определить поправочный коэффициент, γ , который учитывает различия в квантовом выходе и эффективности обнаружения между донором и акцептором. γ рассчитывается как отношение изменения интенсивности акцептора, ΔI A к изменению интенсивности донора, ΔI D при фотообесцвечивании акцептора ( γ = ΔI A IΔI Д ) 21, 56 .Затем рассчитывается скорректированная эффективность FRET с использованием выражения

Белки могут изменять фотофизические свойства флуорофора. Например, мы и другие наблюдали, что флуоресценция ДНК-конъюгированного Cy3 увеличивается, когда белок связывается около 57, 58 . Этот эффект изменяет эффективность FRET за счет изменения γ . Точно так же фотоиндуцированный перенос электронов между основаниями ДНК и красителем может тушить красители, и на это явление может влиять связывание с белками в окрестности 59-61 .

Интерпретация данных: подводные камни и советы

Высокопроизводительные эксперименты на основе TIR помогают нам быстро получать статистически значимые объемы данных. Тогда основной проблемой является анализ и интерпретация данных, которые иногда могут сбивать с толку из-за потенциальных артефактов или двусмысленностей. Вот несколько советов о том, чего следует остерегаться.

  1. Не останавливайтесь на «интересных» эффектах, наблюдаемых в небольшой части (<5%) молекул, потому что на этом уровне многие артефакты невозможно отличить от реальных событий.Вместо этого улучшите биологические конструкции и условия анализа, чтобы большинство молекул функционировало аналогичным образом.

  2. Если поправочный коэффициент γ близок к 1, общий сигнал флуоресценции (сумма интенсивностей донора и акцептора), общий I , должен оставаться постоянным. Постоянные изменения I итого могут быть признаком неспецифической привязанности. Дополнительные источники интенсивного шума включают временное связывание флуоресцентных примесей, изменения свойств красителя из-за взаимодействия с белками или поверхностью или постепенную потерю фокуса.

  3. Длинные видеоролики, показывающие одноэтапные события фотообесцвечивания, должны быть сняты, чтобы убедиться, что полученный сигнал действительно исходит от отдельных молекул.

  4. Обратимое выключение (так называемое мигание) Cy5 (или подобных красителей) 62 — хорошо известный артефакт (см.), Который часто ошибочно интерпретируется как большое изменение конформации в состояние с очень низким FRET, например макромолекулярное разворачивание. Эмпирическое правило заключается в том, что если FRET мгновенно падает до уровня только донора ( E app = 0), считайте, что это мигает.Если очень низкое состояние FRET обнаруживается даже в присутствии средств подавления мигания, таких как Trolox, и если прямое возбуждение акцептора подтверждает его активность, можно исключить мигание. Фотофизические явления, такие как мигание, также можно отличить по их известной зависимости от интенсивности возбуждения 28 .

Хотя анализ данных по отдельным молекулам зависит от системы, стоит упомянуть некоторые часто используемые инструменты. Информацию о свойствах равновесия лучше всего получить с помощью гистограммы smFRET, полученной путем усреднения эффективности FRET каждой молекулы по первым 3-10 точкам данных.Обычно мы получаем 10-20 коротких (~ 5 с) фильмов о различных областях выборки для объективного обзора распределения населения. Временные траектории отдельных молекул (из длинных фильмов) в равновесии передают ценную кинетическую информацию системы через время пребывания в каждом конформационном состоянии. Например, для системы с двумя состояниями, претерпевающих стохастические переходы, скорости переходов определяются из экспоненциального спада, подходящего к распределению времени пребывания каждого состояния 63 , или путем выполнения автокорреляционного анализа в сочетании с определением равновесия, если переходы слишком быстры для надежных определение времени пребывания 64 .Для более сложных переходов между отчетливо идентифицируемыми множественными состояниями можно использовать анализ скрытой марковской модели (HMM) для несмещенной оценки количества заселенных состояний FRET, оценки скорости взаимного преобразования между ними и определения наиболее вероятной временной эволюции каждое состояние 65 (доступно для загрузки на http://bio.physics.uiuc.edu/HaMMy.html). График плотности переходов от начальных к конечным значениям FRET для каждого перехода, полученный из анализа HMM (или другого), обеспечивает визуально привлекательную и объективную компиляцию данных 57, 65-67 .Другие подходы, основанные на теории информации, также доступны для данных о конфокальных одиночных молекулах, полученных фотон за фотоном 68-70 . Преимущества экспериментов с одной молекулой становятся более очевидными в неравновесных условиях, когда можно проследить, например, путь реакции одного фермента, претерпевающего серию переходов для достижения своего каталитического цикла. Мощный визуальный метод представления неравновесных данных smFRET многих молекул был разработан для исследований рибосом 71 .

Ограничения smFRET

Крайне важно указать на некоторые ограничения метода, прежде чем приступить к разработке первого эксперимента smFRET. (1) smFRET требует присоединения по крайней мере двух внешних красителей к интересующей молекуле (ам), поскольку (полу) собственные хромофоры, такие как 2-аминопурин и триптофан, недостаточно яркие или фотостабильные для измерения одиночных молекул. В некоторых случаях сайт-специфическое мечение не является тривиальным, особенно для больших молекул РНК 72, 73 и многих белков 74, 75 .Обратите внимание, что smFRET относительно нечувствителен к неполной разметке. Если донор отсутствует, молекула просто не наблюдается; если акцептор отсутствует, этот вид только-донора обнаруживается как популяция с нулевым FRET. (2) Поскольку обнаружение одиночных молекул достигается за счет пространственного разделения, слабо взаимодействующие флуоресцентные частицы трудно изучать (но не всегда, см. Выше ). (3) FRET нечувствителен к изменениям расстояния за пределами диапазона расстояний между красителями 2-8 нм для R 0 = 5 нм.Однако изменение расстояния до 0,3 нм может быть обнаружено для одиночных молекул между 0,6 R 0 и 1,5 R 0 , где FRET является почти линейной функцией R. (4) Для достижения адекватного сигнала: Отношение к шуму, необходимо зарегистрировать ∼100 полных фотонов. Учитывая, что до фотообесцвечивания можно собрать более 10 5 фотонов из отдельных молекул красителя, можно получить более 10 3 точек данных. (5) Временное разрешение ограничено частотой кадров ПЗС-камеры (в лучшем случае = 1 мс).(6) Абсолютная оценка расстояния является сложной задачей из-за зависимости флуоресцентных свойств и передачи энергии от окружающей среды и ориентации красителей. Таким образом, smFRET использовался в основном для задач, где точная информация о расстоянии не важна. Тем не менее, можно сделать разумные оценки факторов ориентации 76 , и контрольные эксперименты с каждым красителем могут обеспечить хорошее приближение расстояний между красителями 77, 78 . Обеспокоенность по поводу этих проблем может быть дополнительно уменьшена путем использования избыточного количества ограничений расстояния в исследованиях триангуляции 79, 80 .

Усовершенствованные методы smFRET

Некоторые из новых интересных технических разработок, все еще находящихся на стадии проверки принципа работы, кратко изложены ниже.

По мере усложнения исследуемой системы требуется дополнительная информация для устранения неоднозначности. Для этой цели был реализован трехцветный smFRET с использованием Cy3 (донор), Cy5 (акцептор 1) и Cy5.5 (акцептор 2) в качестве трех отдельных флуорофоров, оптимизации конфокальной оптики обнаружения и разработки новой схемы анализа данных 43 .Используя эту технику, были обнаружены коррелированные движения различных сегментов четырехстороннего соединения ДНК (Холлидея). Трехцветный smFRET также работает на основе TIRF и привел к прямому наблюдению за движением белка на одноцепочечной ДНК (неопубликованные результаты). Трехцветное обнаружение одной молекулы также использовалось для различения нескольких видов и наблюдения взаимодействий между тремя разными молекулами 81, 82 . Многоцветная схема возбуждения для дальнейшего различения различных молекулярных частиц 83, 84 недавно была расширена до трехцветной FRET 85 .Также были показаны перспективы дальнейшего расширения FRET с помощью нескольких флуорофоров на отдельных молекулах ДНК 86 .

По мере признания важности механических факторов в биологии, к smFRET добавляется недостающее измерение контролируемого манипулирования силой с конечной целью измерения конформационных изменений с помощью флуоресценции как функции силы, применяемой такими методами, как оптические и магнитные. пинцет. Оптические пинцеты были объединены с функцией расщепления флуоресценции одиночных молекул 87 и FRET 88 , чтобы сообщить о принудительном распаковке шпильки ДНК.Магнитный пинцет использовали для построения калибровочной кривой FRET в зависимости от силы для энтропийной пружины, изготовленной из однонитевой ДНК 89 . Совсем недавно отклик одиночных узлов Холлидея при низкой силе отслеживался с помощью гибридного инструмента, объединяющего FRET и оптический пинцет, чтобы составить карту 2D складывающегося ландшафта 90 . smFRET также был объединен с одноканальной записью простого димерного канала грамицидина 91, 92 .

Заключительные примечания

Мы обсудили практические вопросы хорошо зарекомендовавшего себя smFRET на основе МДП, а также кратко упомянули более футуристические технические разработки.Две области, которые все еще не разработаны, — это измерения в живой клетке, что, вероятно, требует значительных улучшений зондов, и анализ динамики мембранных белков, что уже является сложной задачей на уровне ансамбля. Тем не менее, smFRET является одним из мощных инструментов для «изучения» динамики и взаимодействия отдельных биомолекул в реальном времени. Все, что нам нужно сейчас, — это открыть глаза «одной молекулы» на широкий спектр биомолекулярных взаимодействий, требующих тщательного изучения.

Дополнительный материал

Дополнительные материалы

Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивации поверхности полиэтиленгликолем (PEG)

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

Благодарности

Мы благодарим И. Расника, С. Маккинни, К.Джу, Р. Клегг, С. Мион и члены группы Ха в Университете Иллинойса и К. Дрексхаге из Университета Зигена за экспертные консультации и обсуждение, С. Сайед из Университета Иллинойса за закупку красителей и реагентов и П. Корниш, М. Бреннеру и Л. Суприя за внимательное чтение рукописи. К. Джу подготовил видеоинструкцию по приготовлению слайдов с ПЭГ. Авторская работа по FRET с одной молекулой финансировалась Национальными институтами здравоохранения, карьерной премией Национального научного фонда и Медицинским институтом Говарда Хьюза.SH также была поддержана Фондом научно-исследовательских работ для нового факультета Сеульского национального университета (Корея), грантом Министерства науки и технологий (№ RH0-2005-000-01003-0, 2007) и грантом на фундаментальные научные исследования из Кореи. Исследовательский фонд.

Список литературы

1. Фейнман Р.П. Внизу много места. J Microelectromech Syst. 1992; 1: 60–66. [Google Scholar] 2. Бустаманте С., Брайант З., Смит С.Б. Десять лет напряженности: механика одномолекулярной ДНК. Природа. 2003. 421: 423–427.[PubMed] [Google Scholar] 3. Моернер В.Е., Фромм Д.П. Методы флуоресцентной спектроскопии и микроскопии одиночных молекул. Rev Sci Inst. 2003. 74: 3597–3619. [Google Scholar] 4. Форстер Т. Экспериментальное и теоретическое исследование межмолекулярного переноса энергии электронного возбуждения. Zeitschrift Naturforsch A. 1949; 4: 321–327. [Google Scholar] 5. Ха Т. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции. Методы. 2001; 25: 78–86. [PubMed] [Google Scholar] 6. Вайс С. Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул.Наука. 1999; 283: 1676–1683. [PubMed] [Google Scholar] 7. Joo C, Ha T. In: Методы одиночных молекул: лабораторное руководство. Селвин П., Ха Т, редакторы. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор; NY: 2007. С. 3–36. [Google Scholar] 8. Ha T, et al. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1996; 93: 6264–6268. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9. Капанидис А.Н. и др.Переменное лазерное возбуждение одиночных молекул. Acc Chem Res. 2005; 38: 523–533. [PubMed] [Google Scholar] 10. Michalet X, Weiss S, Jager M. Одномолекулярные флуоресцентные исследования сворачивания белка и конформационной динамики. Chem Rev.2006; 106: 1785–1813. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 11. Зайдель Р., Деккер С. Исследования одномолекулярных двигателей нуклеиновых кислот. Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 80–86. [PubMed] [Google Scholar] 12. Смайли Р.Д., Хаммес Г.Г. Одномолекулярные исследования ферментных механизмов.Chem Rev.2006; 106: 3080–3094. [PubMed] [Google Scholar] 13. Zhuang XW. Одномолекулярная РНК-наука. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2005. 34: 399–414. [PubMed] [Google Scholar] 14. Форстер Т. // Современная квантовая химия. О С, редактор. Академическая пресса; Нью-Йорк: 1967. С. 93–137. [Google Scholar] 16. Дениз А.А. и др. Однопарный резонансный перенос энергии флуоресценции на свободно диффундирующих молекулах: наблюдение зависимости Форстера от расстояния и субпопуляций. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1999; 96: 3670–3675.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17. Best RB, et al. Эффект гибкости и цис-остатков в исследованиях одномолекулярного FRET полипролина. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 18964–18969. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Торговец KA, Best RB, Louis JM, Gopich IV, Eaton WA. Характеристика развернутых состояний белков с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул и молекулярного моделирования. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 1528–1533. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20.Ha T, Chemla DS, Enderle T, Weiss S. Спектроскопия одиночных молекул с автоматическим позиционированием. App Phys Lett. 1997; 70: 782–784. [Google Scholar] 21. Sabanayagam CR, Eid JS, Meller A. Высокопроизводительный сканирующий конфокальный микроскоп для анализа отдельных молекул. App Phys Lett. 2004. 84: 1216–1218. [Google Scholar] 22. Чжуанг X и др. Одномолекулярное исследование катализа и сворачивания РНК. Наука. 2000; 288: 2048–2051. [PubMed] [Google Scholar] 23. Brasselet S, Peterman EJG, Miyawaki A, Moerner WE. Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночных молекул у камелеона, зависимого от концентрации кальция.J. Phys Chem B. 2000; 104: 3676–3682. [Google Scholar] 24. Hohng S, Ha T. Одномолекулярный квантово-точечный флуоресцентный резонансный перенос энергии. Chemphyschem. 2005; 6: 956–960. [PubMed] [Google Scholar] 25. Hohng S, Ha T. Почти полное подавление мерцания квантовых точек в условиях окружающей среды. J Am Chem Soc. 2004; 126: 1324–1325. [PubMed] [Google Scholar] 26. Капанидис А.Н., Вайс С. Флуоресцентные зонды и химия биоконъюгации для анализа флуоресценции одиночных молекул биомолекул. J Chem Phys. 2002; 117: 10953–10964.[Google Scholar] 27. Hubner CG, Renn A, Renge I, Wild UP. Прямое наблюдение тушения триплетного времени жизни одиночных молекул красителя молекулярным кислородом. J Chem Phys. 2001; 115: 9619–9622. [Google Scholar] 28. Расник И., МакКинни С.А., Ха Т. Немигающая и долговременная флуоресцентная визуализация одиночных молекул. Nat Meth. 2006; 3: 891–893. [PubMed] [Google Scholar] 29. Руст MJ, Bates M, Zhuang X. Получение изображений с субдифракционным пределом с помощью микроскопии стохастической оптической реконструкции (STORM) Nat Meth. 2006; 3: 793–795. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30.Виденгрен Дж., Чмыров А., Эггелинг С., Лофдаль П.А., Зайдель С. Стратегии повышения фотостабильности в сверхчувствительной флуоресцентной спектроскопии. J. Phys Chem A. 2007; 111: 429–440. [PubMed] [Google Scholar] 31. Бенеш Р.Е., Бенеш Р. Ферментативное удаление кислорода для полярографии и связанных с ней методов. Наука. 1953; 118: 447–448. [PubMed] [Google Scholar] 32. Aitken CE, Marshall RA, Puglisi J. Система поглощения кислорода для улучшения стабильности красителя в экспериментах по флуоресценции одиночных молекул. Биофиз Дж.2007; 107: 117689. biophysj. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Ву П.Г., Брэнд Л. Резонансная передача энергии — методы и приложения. Анальная биохимия. 1994; 218: 1–13. [PubMed] [Google Scholar] 34. Clegg RM. Флуоресцентный резонансный перенос энергии и нуклеиновые кислоты. Методы Энзимол. 1992; 211: 353–388. [PubMed] [Google Scholar] 35. Murphy MC, Rasnik I, Cheng W, Lohman TM, Ha T. Исследование конформационной гибкости одноцепочечной ДНК с использованием флуоресцентной спектроскопии. Биофиз Дж. 2004; 86: 2530–2537. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36.Рю Й.Х., Шульц П.Г. Эффективное включение неприродных аминокислот в белки Escherichia coli. Nat Meth. 2006; 3: 263–265. [PubMed] [Google Scholar] 37. Хигучи Р., Круммель Б., Сайки РК. Общий метод подготовки in vitro и специфический мутагенез фрагментов ДНК: изучение взаимодействия белков и ДНК. Nucleic Acids Res. 1988; 16: 7351–7367. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Браман Дж. Протоколы мутагенеза in vitro. 2-й. Vol. 182. Humana Press; Тотова, Нью-Джерси: 2001. [Google Scholar] 39.Pennington MW. Процедуры химической модификации для конкретных участков. Методы Мол биол. 1994; 35: 171–185. [PubMed] [Google Scholar] 40. Аксельрод Д. Неинвазивные методы в клеточной биологии. Вили-Лисс; Нью-Йорк: 1990. [Google Scholar] 41. Аксельрод Д. Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения в клеточной биологии. Методы Энзимол. 2003; 361: 1–33. [PubMed] [Google Scholar] 44. Ha T, et al. Инициирование и повторное инициирование раскручивания ДНК реп-геликазой Escherichia coli. Природа. 2002; 419: 638–641. [PubMed] [Google Scholar] 45.София С.Дж., Премнат В.В., Меррилл Е.В. Поли (этиленоксид), привитый к поверхности кремния: плотность прививки и адсорбция белка. Макромолекулы. 1998. 31: 5059–5070. [PubMed] [Google Scholar] 46. Шредер К.М., Блейни П.С., Ким С., Се XS. В: Методы одиночных молекул: лабораторное руководство. Селвин П., Ха Т, редакторы. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор; NY: 2007. С. 461–492. [Google Scholar] 47. Heyes CD, Кобицкий А.Ю., Амиргулова Е.В., Ниенхаус ГУ. Биосовместимые поверхности для специфического связывания отдельных белковых молекул.J. Phys Chem B. 2004; 108: 13387–13394. [Google Scholar] 48. Heyes CD, Groll J, Moller M, Nienhaus GU. Синтез, формирование рисунка и применение звездообразных биофункциональных поверхностей из полиэтиленгликоля. Mol BioSyst. 2007; 3: 419–430. [PubMed] [Google Scholar] 49. Ча Т, Го А, Чжу XY. Ферментативная активность на чипе: критическая роль ориентации белков. Протеомика. 2005; 5: 416–419. [PubMed] [Google Scholar] 51. Okumus B, Wilson TJ, Lilley DM, Ha T. Исследования инкапсуляции везикул показывают, что гетерогенность одиночных молекул рибозима является внутренней.Биофиз Дж. 2004; 87: 2798–2806. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 52. Бенитес Дж. Дж. И др. Исследование временных взаимодействий медных шаперонов и белков болезни Вильсона на уровне одной молекулы с захватом нанопузырьков. J Am Chem Soc. 2008; 130: 2446–2447. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 54. Myong S, Rasnik I., Joo C, Lohman TM, Ha T. Повторяющееся перемещение моторного белка на ДНК. Природа. 2005; 437: 1321–1325. [PubMed] [Google Scholar] 55. Ван дер Меер Б.В. Резонансная передача энергии.Wiley; Чичестер: 1999. [Google Scholar] 56. Ha T, et al. Одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия конформационной динамики и механизма расщепления ферментов. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1999; 96: 893–898. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 57. Джу С. и др. Наблюдение в реальном времени за динамикой волокна RecA с разрешением по одному мономеру. Клетка. 2006; 126: 515–527. [PubMed] [Google Scholar] 58. Ло Г, Ван М, Кенигсберг WH, Се XS. Одномолекулярные и ансамблевые флуоресцентные анализы функционально важных конформационных изменений в ДНК-полимеразе Т7.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 12610–12615. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 59. Клегг Р.М., Мурчи А.И., Зечел А., Лилли Д.М. Наблюдение спиральной геометрии двухцепочечной ДНК в растворе с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1993; 90: 2994–2998. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 60. Купер Дж. П., Хагерман П. Дж. Анализ переноса энергии флуоресценции в дуплексных и разветвленных молекулах ДНК. Биохимия. 1990; 29: 9261–9268. [PubMed] [Google Scholar] 61.Ли С.П., Портер Д., Чирикджян Дж. Г., Кнутсон Дж. Р., Хан М.К. Флуорометрический анализ реакций расщепления ДНК, характеризуемых эндонуклеазой рестрикции BamHI. Анальная биохимия. 1994; 220: 377–383. [PubMed] [Google Scholar] 62. Ha TJ, et al. Временные колебания резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя красителями, конъюгированными с одним белком. Chem Phys. 1999; 247: 107–118. [Google Scholar] 63. Colquhoun D, ​​Hawkes AG. В: Одноканальная запись. Сакманн Б., Нехер Э., редакторы. Пленум Пресс; Нью-Йорк: 1995.С. 397–482. [Google Scholar] 64. Ким HD и др. Mg2 + -зависимые конформационные изменения РНК изучали с помощью корреляции флуоресценции и FRET на иммобилизованных одиночных молекулах. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2002; 99: 4284–4289. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 65. McKinney SA, Joo C, Ha T. Анализ траекторий FRET одиночных молекул с использованием скрытого марковского моделирования. Biophys J. 2006; 91: 1941–1951. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 66. Манро Дж. Б., Альтман Р. Б., О’Коннор Н., Бланшар, Южная Каролина. Идентификация двух различных промежуточных продуктов гибридного состояния на рибосоме.Mol Cell. 2007. 25: 505–517. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 67. Myong S, Bruno MM, Pyle AM, Ha T. Пружинный механизм раскручивания ДНК геликазой NS3 вируса гепатита C. Наука. 2007; 317: 513–516. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 68. Ян Х, Се XS. Зондирование фотона динамики одной молекулы фотоном. J Chem Phys. 2002; 117: 10965–10979. [Google Scholar] 69. Андрек М, Леви Р.М., Талага Д.С. Прямое определение кинетических скоростей по траекториям прихода фотонов одной молекулы с использованием скрытых марковских моделей.J. Phys Chem A. 2003; 107: 7454–7464. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 70. Шредер Г.Ф., Грубмюллер Х. Траектории максимального правдоподобия из экспериментов по резонансному переносу энергии флуоресценции одиночных молекул. J Chem Phys. 2003; 119: 9920–9924. [Google Scholar] 71. Бланшар СК, Гонсалес Р.Л., Ким Х.Д., Чу С., Пуглиси ДжейДи. Отбор тРНК и кинетическая корректура при переводе. Nat Struct Mol Biol. 2004. 11: 1008–1014. [PubMed] [Google Scholar] 72. Смит Г.Дж., Сосник Т.Р., Шерер Н.Ф., Пан Т. Эффективное флуоресцентное мечение большой РНК посредством гибридизации олигонуклеотидов.РНК. 2005; 11: 234–239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 73. Dorywalska M, et al. Сайт-специфическая маркировка рибосомы для спектроскопии одиночных молекул. Nucleic Acids Res. 2005. 33: 182–189. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 74. Дениз А.А. и др. Сворачивание одномолекулярного белка: исследования диффузионного флуоресцентного резонансного переноса энергии денатурации ингибитора химотрипсина 2. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000; 97: 5179-5184. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 75. Ягер М, Нир Э, Вайс С.Сайт-специфическая маркировка белков для одномолекулярного FRET путем комбинирования химической и ферментативной модификации. Protein Sci. 2006. 15: 640–646. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 76. Дейл Р.Э., Эйзингер Дж., Блумберг В.Е. Ориентационная свобода молекулярных зондов — фактор ориентации во внутримолекулярной передаче энергии. Биофиз Дж. 1979; 26: 161–193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 77. Schuler B, Lipman EA, Steinbach PJ, Kumke M, Eaton WA. Полипролин и «спектроскопическая линейка» заново с флуоресценцией одиночных молекул.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2005; 102: 2754–2759. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 78. Ротвелл П.Дж. и др. Многопараметрическая флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул выявляет гетерогенность комплексов обратной транскриптазы ВИЧ-1: праймер / матрица. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100: 1655–1660. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 79. Rasnik I, Myong S, Cheng W, Lohman TM, Ha T. Ориентация связывания ДНК и конформация домена мономера реп-геликазы E. coli, связанного с частичным дуплексным соединением: исследования одной молекулы флуоресцентно меченых ферментов.J Mol Biol. 2004. 336: 395–408. [PubMed] [Google Scholar] 81. Кламм Дж. П., Дениз А. А.. Трехцветный резонансный перенос энергии флуоресценции одной молекулы. Chemphyschem. 2005; 6: 74–77. [PubMed] [Google Scholar] 82. Хайнце К.Г., Янц М., Швилле П. Анализ совпадений трех цветов: еще один шаг в изучении образования молекулярных комплексов более высокого порядка. Биофиз Дж. 2004; 86: 506–516. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 83. Капанидис А.Н. и др. Сортировка молекул с помощью флуоресценции: анализ структуры и взаимодействий с помощью переменного лазерного возбуждения отдельных молекул.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004; 101: 8936–8941. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 85. Ли Н.К. и др. Трехцветное переменное лазерное возбуждение отдельных молекул: мониторинг множественных взаимодействий и расстояний. Биофиз Дж. 2007; 92: 303–312. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 86. Heilemann M, et al. Многоступенчатая передача энергии в одиночных молекулярных фотонных проволоках. J Am Chem Soc. 2004; 126: 6514–6515. [PubMed] [Google Scholar] 87. Ланг М., Фордайс П., Энг А., Нойман К., Блок С. Комбинированная флуоресцентная и силовая микроскопия.Biophys J. 2003; 84: 301a – 301a. [Google Scholar] 88. Tarsa PB, et al. Обнаружение индуцированных силой молекулярных переходов с резонансным переносом энергии флуоресценции. Angew Chem Int Ed. 2007; 46: 1999–2001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 89. Шрофф Х. и др. Биосовместимый датчик силы с оптическим считыванием и размерами 6 нм (3) Nano Lett. 2005; 5: 1509–1514. [PubMed] [Google Scholar] 90. Hohng S, et al. Флуоресцентно-силовая спектроскопия отображает двумерный ландшафт реакций холлидея.Наука. 2007. 318: 279–283. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 92. Harms GS, et al. Зондирование конформационных изменений ионных каналов грамицидина с помощью флуоресцентной микроскопии с фиксацией одиночных молекул. Биофиз Дж. 2003; 85: 1826–1838. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 93. Tan E, et al. Четырехстороннее соединение ускоряет складывание шпилечного рибозима посредством дискретного промежуточного соединения. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100: 9308–9313. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 94. Haugland R. Справочник по флуоресцентным датчикам и исследовательским продуктам.9-е. Молекулярные зонды; Юджин, штат Орегон: 2002. [Google Scholar] 95. Jager M, Michalet X, Weiss S. Взаимодействие белков с белками как инструмент для сайт-специфической маркировки белков. Protein Sci. 2005. 14: 2059–2068. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 96. Ратнер В., Кахана Е., Эйхлер М., Хаас Э. Общая стратегия сайт-специфичного двойного мечения глобулярных белков для кинетических исследований FRET. Bioconjug Chem. 2002; 13: 1163–1170. [PubMed] [Google Scholar]

Официальное уведомление — FRET 21: грузоотправители заботятся о климате!

Сайт состоит из всех страниц, привязанных к имени www.fret21.eu является собственностью Ассоциации пользователей грузовых перевозок, регулируемой законом 1901.

В соответствии со статьей 6 Закона № 2004-575 от 21 июня 2004 года о доверии к цифровой экономике, пользователи сайта fret21.eu информируются о личности различных сторон, участвующих в его реализации и мониторинге:

Владелец : A.U.T.F. Association des Utilisateurs de Transport de Fret — Ассоциация, объявленная в префектуре под номером 385 290 309, представлена ​​Дени ШУМЕР, исполняющим обязанности президента — 91 rue du Faubourg St Honoré 75008 PARIS — Тел: 01 42 68 34 80
Создатель : Агентство La nageuse и Master Films
Директор по публикации : Mr.Кристиан РОУЗ в качестве генерального делегата — [email protected] — Тел .: +33 (0) 1 42 68 34 80

Веб-мастер : Жером Мерио — [email protected]
Хост : HOST PAPA — AV DE L’ARCHE 92400 COURBEVOIE
Условия использования

Использование этого сайта требует принятия всех этих условий, изложенных ниже.
Информация размещена на сайте

Информация представлена ​​на сайте www.fret21.eu предназначен только для информационных целей. AUTF не гарантирует точность, полноту и своевременность информации, представленной на сайте. AUTF прилагает все усилия, чтобы предоставить пользователям доступную и проверенную информацию и / или инструменты, но не может нести ответственность за ошибки или упущения, недоступность информации и услуг. Следовательно, пользователь признает, что он или она использует эту информацию под свою исключительную ответственность. Пользователь заявляет, что прочитал вышеуказанную информацию перед посещением сайта.Выбирая доступ к сайту, пользователь прямо и безоговорочно принимает следующие условия.


Файлы cookie браузера

Файл cookie не позволяет нам идентифицировать вас; тем не менее, он записывает информацию, относящуюся к просмотру нашего сайта вашим компьютером (просмотренные вами страницы, дата и время консультации и т. д.), которую мы сможем прочитать во время ваших последующих посещений. Эта информация хранится на вашем компьютере от 7 дней до 1 года.
Сообщаем вам, что вы можете отказаться от записи файлов cookie, настроив свой браузер следующим образом:
Для Microsoft Internet Explorer:

  1. выберите меню «Сервис», затем «Свойства обозревателя».
    2. Щелкните вкладку «Конфиденциальность».
    3. Выберите желаемый уровень курсором.

Для Netscape:

  1. выберите меню «Правка»> «Настройки».
    2. Конфиденциальность и безопасность
    3.Печенье

Для Firefox:

  1. выберите меню «Инструменты»> «Параметры».
    2. Нажмите на опцию «Конфиденциальность»
    3. Раздел «Cookies»

Для Opera:

  1. выберите меню «Файл»> «Настройки».
    2. Конфиденциальность

Гипертекстовые ссылки

AUTF не несет ответственности за содержание сайтов, на которые есть ссылки. Настройка гипертекстовых ссылок на страницы или документы, опубликованные на fret21.Сайт eu авторизован, если ссылки гарантируют возможность определения AUTF-происхождения документа. Пользователь должен сообщить AUTF заранее. Любое использование информации должно быть предметом запроса на разрешение, которое может быть запрошено в коммуникационном отделе AUTF. Авторизация будет предоставлена, если запрос не противоречит интересам AUTF. AUTF оставляет за собой право привлекать к ответственности любое лицо, которое не соблюдает применение этих правил.
Сайт www.fret21.eu — это портал, предоставляющий доступ к другим сайтам, которые могут иметь свои собственные юридические уведомления, с которыми следует обращаться и уважать.
Вашему вниманию

Напоминаем, что невозможно гарантировать конфиденциальность сообщений, передаваемых через Интернет. Поэтому, если вы хотите передать сообщение в более надежных условиях, мы рекомендуем вам воспользоваться почтовой службой. AUTF снимает с себя всякую ответственность за любые технические трудности, с которыми вы можете столкнуться на сайте, независимо от их причины и происхождения.
Изменение юридических уведомлений

AUTF оставляет за собой право изменять эти уведомления в любое время. Пользователь связан условиями, действующими на момент его посещения.
Применимое право в случае спора

Применимое право — французское право.
Исключительная юрисдикция в отношении любого спора предоставляется компетентным судам в рамках юрисдикции Апелляционного суда Парижа (Франция).
2015 — AUTF — Все права защищены — Официальное уведомление

основа для количественных измерений FRET в живых клетках

% PDF-1.4
%
1 0 объект
>
эндобдж
10 0 obj

/Заголовок
/Тема
/ Автор
/Режиссер
/ CreationDate (D: 20211026225345-00’00 ‘)
/ Ключевые слова ()
/ ModDate (D: 20200410121058 + 02’00 ‘)
/ doi (10.1038 / s41598-020-62924-w)
>>
эндобдж
2 0 obj
>
эндобдж
3 0 obj
>
эндобдж
4 0 obj
>
эндобдж
5 0 obj
>
эндобдж
6 0 obj
>
эндобдж
7 0 объект
>
транслировать
application / pdfdoi: 10.1038 / s41598-020-62924-w

  • Springer US
  • Научные отчеты, DOI: 10.1038 / s41598-020-62924-w
  • QuanTI-FRET: основа для количественного измерения FRET в живых клетках
  • 10.© 2020, Автор (ы) 2045-232210.1038 / s41598-020-62924-wSpringer2020-04- 10T12: 10: 58 + 02: 002020-04-09T13: 48: 41 + 05: 302020-04-10T12: 10: 58 + 02: 00TrueiText® 5.3.5 © 2000-2012 1T3XT BVBA (SPRINGER SBM; лицензионная версия) VoRuuid: d9342a1c-d6c3-4f74-a3d5-3d03fec7e1a8uuid: 25a5ce3e-36bd-4fa6-a276-8269767c830adefault1

  • сконвертированоuuid: f1f504be-3a84-4af4-bbc: f1f504be-3a84-4af4-bbc22: 4904e-bbcddd-bbc2-bbc2-bbc2-bbc2-bbc2-bbc2-bbc2-bbc2-bbc2-bbc2-bbc2-bbc3 30
  • 2B

  • http: // ns.adobe.com/xap/1.0/mm/xmpMMXMP Схема управления носителями
  • Внутренний идентификатор на основе UUID для конкретного воплощения документа InstanceIDURI
  • internal Общий идентификатор для всех версий и представлений документа. Оригинал Документ IDURI
  • http://ns.adobe.com/pdf/1.3/pdfAdobe PDF Schema
  • internal Объект имени, указывающий, был ли документ изменен для включения информации о треппинге TrappedText
  • http: // ns.adobe.com/pdfx/1.3/pdfxpdfx
  • внутренний идентификатор стандарта PDF / X GTS_PDFXVersionText
  • внутренний Уровень соответствия стандарту PDF / X GTS_PDFXConformanceText
  • internal Компания, создающая PDFCompanyText
  • internal Дата последнего изменения документа SourceModifiedText
  • Кроссмарк для внутренних зеркал: DOIdoiText
  • http: // www.aiim.org/pdfa/ns/id/pdfaidPDF/A ID Schema
  • internalPart of PDF / A standardpartInteger
  • внутренняя Поправка к стандарту PDF / A amdText
  • внутренний Уровень соответствия стандарту PDF / A Текст
  • http://prismstandard.org/namespaces/basic/2.0/prismPrism
  • external Тип агрегирования определяет единицу агрегирования для коллекции контента.
    Комментарий
    PRISM рекомендует использовать словарь с контролируемым типом агрегирования PRISM для предоставления значений для этого элемента.Примечание: PRISM не рекомендует использовать значение #other, разрешенное в настоящее время в этом контролируемом словаре. Вместо использования #other обратитесь к группе PRISM по адресу [email protected], чтобы запросить добавление вашего термина в словарь с контролируемым типом агрегирования.

    aggregationTypeText

  • externalCopyright copyrightText
  • external — цифровой идентификатор объекта для статьи.
    DOI также может использоваться как идентификатор dc :.Если используется в качестве идентификатора dc: identifier, форма URI должна быть захвачена, а пустой идентификатор также должен быть захвачен с помощью prism: doi. Если в качестве требуемого идентификатора dc: identifier используется альтернативный уникальный идентификатор, то DOI следует указывать как чистый идентификатор только в пределах prism: doi.
    Если URL-адрес, связанный с DOI, должен быть указан, тогда prism: url может использоваться вместе с prism: doi для предоставления конечной точки службы (то есть URL-адреса).
    doiText
  • externalISSN для электронной версии проблемы, в которой встречается ресурс.Разрешает издателям включать второй ISSN, идентифицирующий электронную версию проблемы, в которой встречается ресурс (следовательно, e (lectronic) Issn. Если используется, prism: eIssn ДОЛЖЕН содержать ISSN электронной версии. См. Prism: issn.
    issnText
  • external Название журнала или другого издания, в котором был / будет опубликован ресурс.
    Обычно это используется для предоставления названия журнала, в котором появилась статья, в качестве метаданных для статьи, а также такой информации, как название статьи, издатель, том, номер и дата обложки.Примечание. Название публикации можно использовать для различения печатного журнала и онлайн-версии, если названия разные, например «журнал» и «magazine.com».
    PublicationNameText
  • externalЭтот элемент предоставляет URL-адрес статьи или единицы контента.
    Платформа атрибутов необязательно разрешена для ситуаций, в которых необходимо указать несколько URL-адресов. PRISM рекомендует использовать вместе с этим элементом подмножество значений платформы PCV, а именно «мобильный» и «Интернет».ПРИМЕЧАНИЕ. PRISM не рекомендует использовать значение #other, разрешенное в управляемом словаре платформы PRISM. Вместо использования #other обратитесь к группе PRISM по адресу [email protected], чтобы запросить добавление вашего термина в словарь, контролируемый платформой.
    urlText
  • http://www.niso.org/schemas/jav/1.0/javNISO
  • external Значения для версии статьи журнала являются одним из следующих:
    AO = Авторский оригинал
    SMUR = Представленная рукопись на рассмотрении
    AM = принятая рукопись
    P = Доказательство
    VoR = версия записи
    CVoR = Исправленная версия записи
    EVoR = Расширенная версия Recordjournal_article_versionClosed Выбор текста
  • конечный поток
    эндобдж
    8 0 объект
    >
    эндобдж
    9 0 объект
    >
    эндобдж
    11 0 объект
    >
    эндобдж
    12 0 объект
    >
    эндобдж
    13 0 объект
    >
    эндобдж
    14 0 объект
    >
    эндобдж
    15 0 объект
    >
    эндобдж
    16 0 объект
    >
    эндобдж
    17 0 объект
    >
    эндобдж
    18 0 объект
    >
    эндобдж
    19 0 объект
    >
    эндобдж
    20 0 объект
    >
    эндобдж
    21 0 объект
    >
    эндобдж
    22 0 объект
    >
    / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageB / ImageI]
    >>
    эндобдж
    23 0 объект
    >
    транслировать
    x ڝ Xn # 7 + Cw @! Ȃ6oAn˚KdebCH * r_
    ,% + N / LJ / ~ q
    1pßy — p \ xvor9p & z: • \ ie ~ 4> 寇 ߗ ސ $ 5 瀂 @] & | d, YT7N; d — «} q

    Фотостабильность с усилением FRET позволяет улучшить отслеживание одиночных молекул белков и белковых комплексов вживую. клетки млекопитающих

    Анализ структуры белка

    Данные опубликованных кристаллических структур были проанализированы с использованием пакета UCSF Chimera 55 .Программное обеспечение Chimera также использовалось для создания рисунков для этой статьи. Список проанализированных белковых структур выглядит следующим образом: mEos3.2 (PDB ID: 3P8U) 56 , HaloTag (PDB ID: 4KAA) 57 , тег SNAP (PDB ID: 3KZZ) 58 и CENP -Нуклеосома (PDB ID: 3AN2) 44 .

    Экспрессия белков mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP-tag

    Конструкция mEos3.2-HaloTag была клонирована из плазмид, содержащих mEos3.2 59 и HaloTag (Promega), слитых через короткий линкер (Leu- Glu-Gly-Ser) и вставляли в расщепленный EcoRI / HindIII экспрессионный вектор pET30a с использованием набора для клонирования In-Fusion HD (Clontech).Таким же образом клонировали конструкцию HaloTag-SNAP. Затем проводили сайт-направленный мутагенез вектора mEos3.2-HaloTag для создания слитой конструкции с другой длиной линкера (ΔARRELEGSE).

    His-tagged конструкции mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP были экспрессированы в клетках E. coli BL21 (DE3) pLysS путем выращивания литра клеток из 50-мл заквасочной культуры до OD 600 нм 0,7–1,0 в среде LB, содержащей 35 мкг / мл канамицина и 34 мкг / мл хлорамфеникола, перед индукцией экспрессии с использованием 1 мМ IPTG (Melford Laboratories Ltd) в течение 4 ч при 25 ° C.Клетки осаждали и хранили при -20 ° C. Для очистки белка клетки быстро размораживали при 37 ° C и ресуспендировали в трех объемах буфера для лизиса (50 мМ Hepes pH 7,5, 300 мМ NaCl, 5% глицерин и коктейль ингибиторов протеазы (Roche)) на объем осадка. Затем ресуспензию клеток обрабатывали ультразвуком в течение 13 минут с амплитудой 33% (5 с при включении и 10 с при выключении) с использованием Sonic Dismembrator (модель 505, Fisher Scientific), обломки клеток осаждали, а лизат белка собирали и фильтровали через 0,45- мкм фильтр.

    Слитые белки сначала очищали с помощью аффинной хроматографии на никеле. Лизат белка ресуспендировали в 5 мл суспензии шариков 50% Ni-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA) (Qiagen), предварительно уравновешенной в буфере (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, pH 8,0) и вращали в течение ночи при 4 ° C. Слитый белок очищали с использованием гравитационной колонки объемом 20 мл (Bio-Rad), промывали тремя объемами колонки промывочного буфера (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, 5 мМ имидазол, pH 8.0) и, наконец, элюировали 10 мл буфера для элюирования (50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, 250 мМ имидазол, pH 8,0). Затем белок диализовали (в 50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, pH 8,0) для удаления имидазола с использованием Vivaspin 500 с отсечкой по молекулярной массе (MWCO) 5 кДа (Sartorius Stedim Biotech). Затем слитый белок дополнительно очищали гель-фильтрацией в буфере, состоящем из 50 мМ NaH 2 PO 4 и 1 М NaCl (колонка 75 мл Sephadex200, GE Healthcare).Для проверки массы белка (65096,8 Да) проводили масс-спектрометрию, а для определения его концентрации использовали аминокислотный анализ. Белок хранили в аликвотах по 500 мкл с концентрацией 1 мг / мл при -80 ° C и повторно очищали с использованием эксклюзионной хроматографии перед маркировкой красителя. Слитые белки (5–10 мкМ) метили лигандами HaloTag-dye или SNAP-tag-краситель путем их реакции в эквимолярном соотношении при комнатной температуре в течение 1 ч перед очисткой с использованием гравитационной колонки Illustra Nap-5 (GE Healthcare ).Масс-спектрометрия подтвердила, что метка близка к 100%.

    Красители HaloTag или SNAP-tag PA-JF 549 и JF 646 были любезным подарком от Люка Д. Лависа (HHMI) 60 .

    Характеристика спектров объемной флуоресценции

    Спектры объемной флуоресценции были получены с использованием mEos3.2 или PA-JF 549 с красителем JF 646 или без него (15–25 мкМ) с использованием флуоресцентного спектрофотометра (Cary Eclipse). Образец помещали в кварцевую кювету (Hellma Analytics, 3 × 3 мм).Чтобы определить фактическую эффективность FRET белков mEos3.2-HaloTag с различными красителями, спектры излучения были собраны после возбуждения при 532 нм и регистрации флуоресценции в диапазоне длин волн (550-800 нм). Эффективность FRET ( E ) была рассчитана с использованием стандартного уравнения (уравнение 1):

    $$ E = 1 — \ frac {{I _ {\ rm D} \ prime}} {{I _ {\ rm D}} }, $$

    где \ (I _ {\ rm D} \) — интенсивность флуоресценции одного донорного флуорофора (mEos3.2), а \ (I _ {\ rm D} \ prime \) — интенсивность флуоресценции донор в присутствии акцептора (mEos3.2 \) — фактор ориентации диполя (\ (\ frac {2} {3} \) для свободно вращающихся донорных и акцепторных флуорофоров), \ (Q _ {\ rm D} \) — квантовый выход донора mEos3.2 или PA-JF 549 флуорофоров (0,55 и 0,88 соответственно), n — показатель преломления среды (1,33), а J — интеграл спектрального перекрытия между донорами mEos3.2 или PA-JF 549 и акцепторный JF 646 спектры, рассчитанные на разных длинах волн λ с использованием коэффициента экстинкции \ ({\ it {\ epsilon}} _ {\ rm A} \) акцептора JF 646 красителя (максимальное значение 152000 M −1 см −1 ) (Ур.4 \ mathrm {d} \ lambda. $$

    Визуализация времени жизни флуоресценции

    Измерения временного коррелированного подсчета одиночных фотонов (TCSPC) были выполнены на системе Leica SP8 STED 3 ×, дополнительно оснащенной программным обеспечением Single Molecule Detection (SMD) (SymPhoTime версия 5.3.2.2) и оборудование (PicoHarp 300; PHR 800) от PicoQuant. Возбуждение флуоресценции в этой системе осуществлялось с помощью настраиваемого импульсного (80 МГц) лазера белого света (WLL; Super-K; NKT Photonics), в то время как обнаружение флуоресценции осуществлялось с помощью внутреннего гибридного детектора одиночных молекул (Leica HyD SMD).Возбуждение донора осуществляли на длине волны 561 нм с полосой обнаружения 570-620 нм и с использованием водно-иммерсионного объектива 20 × 0,75 NA (HC PL APO CS2) с коэффициентом масштабирования 1 × и скоростью сканирования 400 Гц. , и с накоплением кадров 25 изображений. Фотоактивация / преобразование достигались с использованием лазера 405 нм в течение 1 мин при мощности активации 1,75 кВт / см 2 в фокальной плоскости объектива до измерения срока службы. Увеличение эмиссии доноров произошло после активации / конверсии, как и ожидалось.Измерения FLIM проводили в трех экземплярах до и после активации / конверсии очищенного белка в 50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, pH 8,0 на 8-луночных μ-предметных стеклах со стеклянным дном (iBidi). Белок прикрепляли к покровному стеклу путем инкубации с поли-L-лизином (Sigma Aldrich) в течение 30 минут, а затем с 5–10 мкМ белка в течение 10 минут. Буфер был заменен, чтобы удалить плавающий белок, а затем визуализация прикрепленного белка была проведена путем фокусирования на покровном стекле. Присоединение было подтверждено визуализацией, чтобы гарантировать, что фотопреобразованные молекулы не диффундируют с течением времени.

    Данные о распаде TCSPC после активации / преобразования анализировали с использованием программного обеспечения SymPhoTime (версия 2. {- t / \ tau _i} $$

    где I Bkgd — смещение интенсивности для подсчета фона, а \ (\ alpha _i \) и \ (\ tau _i \) — значения амплитуды и времени жизни для i -й экспоненты, где мы сравнивали соответствия для 1 ≤ i ≤ 3 (т.е.е., моно-, би- и трехэкспоненциальные аппроксимации). Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных с помощью байесовского информационного критерия (BIC) 62,63 . Короче говоря, используя этот подход, мы рассчитали BIC для каждой модели из (Ур. 6)

    $$ \ mathrm {BIC} = \ ln [n] (p + 1) + n \ left ({\ ln \ left [{\ frac {{2 \ pi {\ rm RSS}}} {n}} \ right] + 1} \ right), $$

    , где n — количество точек данных, p — это количество свободных параметров для подгонки, а RSS — остаточная сумма квадратов подбора.Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных из (Уравнение 7):

    $$ {\ mathrm {Relative}} \; {\ mathrm {Likelihood}} = {\ mathrm {Exp}} \ left [{ \ frac {{{\ mathrm {BIC}} _ ​​{{\ mathrm {Min}}} {\ mathrm {(модель) -}} {\ mathrm {BIC (модель)}}}} {2}} \ right] . $$

    Данные для mEos3.2 с JF 646 и без него и PA-JF 549 с JF 646 и без него можно описать двумя сроками службы. Мы определили эффективность FRET ( E ), используя среднее время жизни флуоресценции (уравнение.8):

    $$ E = 1 — \ frac {{\ tau _ {{\ rm DA}}}} {{\ tau _ {\ rm D}}}, $$

    где \ (\ tau _ {\ rm D} \) — средневзвешенное по амплитуде время жизни флуоресценции только донорского флуорофора (mEos3.2 или PA-JF 549 ), а \ (\ tau _ {{\ rm DA}} \) — амплитуда средневзвешенное время жизни флуоресценции донора в присутствии акцептора (mEos3.2 – JF 646 или PA-JF 549 –JF 646 ).

    Установка микроскопа

    В этой работе использовались две сделанные на заказ установки микроскопа, обе из которых описаны ниже.Таблицу с подробным описанием конкретных параметров, используемых для каждого эксперимента, можно найти в дополнительной информации.

    Микроскоп 1: использовался инвертированный микроскоп IX71 Olympus с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре масляного объектива Olympus 1,49 NA 60 × (Plan Apochromat 60 × NA 1,49, Olympus APON 60XOTIRF). Используемые источники света диодных лазеров с непрерывной длиной волны включают 561 нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и 405-нм лазер (Oxxius, LaserBoxx 405, 100 мВт).Полное внутреннее отражение достигалось смещением лазера от оси таким образом, чтобы выходящий луч на границе раздела образцов был почти коллимированным и падал под углом, превышающим критический угол θ c ~ 67 ° для границы раздела стекло / вода для Визуализация TIRF и немного меньше θ c для визуализации с косоугольным освещением. Это создавало след возбуждения диаметром ~ 50 мкм. Для TIRF плотность мощности на покровном стекле для лазера 561 нм была рассчитана приблизительно равной 0.4 кВт / см 2 измерено лазерным лучом при эпи-освещении. Для косоугольного освещения мощность коллимированных лучей на задней апертуре микроскопа составляла 10 кВт / см 2 и 10–100 Вт / см 2 для лазерных лучей 561 нм и 405 нм соответственно. Лазеры отражались дихроичными зеркалами, которые также отделяли собранное флуоресцентное излучение от пучка TIR (Semrock, Di01-R405 / 488/561/635). Эмиссия флуоресценции собиралась через тот же объектив, а затем дополнительно фильтровалась с использованием комбинации длиннопроходных и полосовых фильтров (BLP01-561R и FF01-587 / 35 для возбуждения 561 нм).Эмиссионный сигнал расширялся с помощью расширителя ахроматического луча 2,5 × (Olympus, PE 2,5 × 125) и, наконец, проецировался на EMCCD (Photometrics, Evolve 512) с усилением электронного умножения 250 ADU / фотон, работающим в режиме передачи кадров. Инструмент был автоматизирован с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом micro-manager (https://www.micro-manager.org), а данные отображались с помощью программного обеспечения ImageJ 64,65 .

    Микроскоп 2: использовался инвертированный микроскоп IX73 Olympus с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре Olympus 1.40 NA 100 × масляный объектив (Universal Plan Super Apochromat, 100 ×, NA 1.40, UPLSAPO100XO / 1.4). Используемые источники света диодных лазеров с непрерывной длиной волны включают 641 нм (когерентный, CUBE 640–100 C, 100 мВт), 561 нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и 405-нм лазер (Stradus, Toptica, 405–100, 100 мВт). Визуализация TIRF и косоугольного освещения выполнялась с использованием идентичных дихроичных зеркал и фильтров излучения. Сигнал излучения проецировался на EMCCD (Photometrics, Evolve 512 Delta) с усилением электронного умножения 250 ADU / фотон, работающий в режиме передачи кадров.Инструмент был автоматизирован с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом micro-manager (https://www.micro-manager.org), а данные отображались с помощью программного обеспечения ImageJ 64,65 .

    TIRF-характеристика красителей mEos3.2-HaloTag

    Покровные стекла из боросиликатного стекла (VWR Int, 22 × 22 мм) очищали для удаления любых флуоресцентных остатков в очистителе аргоновой плазмы (плазма Харрика) в течение 1 часа. Камеры для инкубации с герметичной рамкой (Bio-rad) прикрепляли к покровному стеклу и 50 мкл 0,1% поли-L-лизина (Sigma Aldrich) добавляли в центр камеры на 30 мин; Затем к покровному стеклу, покрытому поли-L-лизином, добавляли 50 мкл 10 нМ белка на 10-15 мин.Образец трижды промывали 50 мкл фильтрованной (шприц-фильтр 0,2 мкм, Whatman, 6780–1302) воды MilliQ, и изображения флуоресценции, собранные в виде видеозаписей из 500 изображений, при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование производилось одиночным импульсом в первом кадре каждого фильма.

    Анализ фотофизических параметров

    Эксперимент был воспроизведен в лаборатории дважды на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2. Хотя все эксперименты показали схожие результаты, мы решили проанализировать наборы данных с Микроскопа 1, записанные в тот же день, чтобы уменьшить возникающие систематические ошибки. от слегка различающихся настроек микроскопа.Мы проанализировали фильмы, собранные в тот же день с микроскопа 1, в которых мы отслеживали 455 и 454 одиночных mEos3.2 и mEos3.2 – JF 646 молекулу без Trolox, 990 и 1568 одиночных mEos3.2 и mEos3.2 – JF 646 молекулы с 2 мМ Trolox. Учитывая, что 20% одиночных молекул mEos3.2 – JF 646 находились во включенном состоянии значительно дольше, чем одиночные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки, чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения. Все гистограммы были созданы с использованием пакета Origin (OriginLab, Northampton, MA).

    Здесь приводится краткое описание программного обеспечения, используемого для анализа данных. Проекция с максимальной интенсивностью первых двух изображений после фотопреобразования использовалась в качестве основы для обнаружения одиночных молекул. К проекции был применен фильтр Лапласа гаусса, и были найдены локальные максимумы. Скрипты для этого доступны на https://github.com/TheLaueLab/blob-detection, а для всех остальных шагов — на https://github.com/TheLaueLab/blink-analysis. Область с центром на каждом пике с пороговым значением> 600 ADU была извлечена из каждого изображения.Эта область состояла из области сигнала 7 на 7 пикселей и окружающей фоновой области шириной 2 пикселя. Отдельные кадры были упрощены до одномерных графиков путем вычитания среднего покадрового фона из соответствующего кадра, а затем взятия среднего значения всех пикселей в этом кадре. Скрытая марковская модель (с использованием пакета python hmmlearn из https://github.com/hmmlearn/hmmlearn) была настроена с четырьмя состояниями: двумя включенными состояниями, одним выключенным и одним обесцвеченным. Переходы были одинаково вероятны между всеми включенными и выключенными состояниями и 1/10 вероятности из любого включенного состояния в обесцвеченное состояние (переход от обесцвеченного состояния был невозможен).Состояния были инициализированы со средним значением 300 ADU для включенного состояния и 0 для выключенного и обесцвеченного состояний, с предварительным весом 1e3, присвоенным среднему состоянию. Модель была обучена на всех следах от определенного флуорофора, и одна и та же обученная модель использовалась для категоризации всех следов.

    Общее время в открытом состоянии каждой молекулы было рассчитано путем подсчета количества изображений в открытом состоянии. Мигание было определено как серия последовательных изображений; средняя длина цикла, умноженная на время воздействия, представляет собой время включения, а количество циклов, обнаруженных для конкретной молекулы, представляет собой количество событий переключения.Скорость выключения — это количество миганий, разделенное на общее время включения, а скорость включения — это количество миганий, разделенное на общее время выключения (исключая последний запуск вне кадра, если он продолжался до конец видео).

    Наконец, было вычислено полное излучение фотонов для каждого изображения, вычитая среднее значение области фона из области сигнала. Чтобы рассчитать количество испускаемых фотонов на молекулу, общее усиление камеры в аналого-цифровых единицах (ADU) / фотон было определено по формуле (Ур.9)

    $$ G _ {{\ rm total}} = \ frac {1} {{G _ {{\ rm camera}}}} \ times G _ {{\ rm EM}} \ times {\ rm QE}, $$

    , где G камера — это усиление сигнала, присущее EMCCD в единицах ADU / электрон, G EM — отношение заряда камеры с усилением и без него, а QE — это коэффициент усиления. квантовая эффективность — способность камеры производить заряд в результате падающего фотона с единицами электронов / фотонов. G итого это 33.1 ADU / фотон и 35,7 ADU / фотон для микроскопов 1 и 2 соответственно.

    Измеренный сигнал ( I ) в единицах электронов был преобразован в испускаемые фотоны ( n ) следующим образом (уравнение 10):

    $$ n = \ frac {I} {{G _ {{\ rm total}} \ times {\ rm TE}}}. $$

    TE определяется как эффективность передачи всех оптических компонентов на пути излучения прибора и может быть описана формулой (11)

    $$ { \ rm TE} = \ eta _ {{\ rm coll}} \ times T \ times \ eta _ {{\ rm EMCCD}}, $$

    , где η coll — эффективность сбора объективом, T — это пропускание внутренних оптических компонентов микроскопа, а η EMCCD — квантовая эффективность EMCCD 66 .

    Культура клеток млекопитающих и генерация линии клеток

    ES-клетки культивировали в стандартных условиях сыворотки и фактора ингибирования лейкемии мышей (mLIF): минимальная необходимая среда Глазго (Sigma-Aldrich G5154), содержащая 100 мМ 2-меркаптоэтанола (Life tech, кат. 21985023), 1 × Minimum Essential Media, незаменимые аминокислоты (Sigma-Aldrich, M7145), 2 мМ L-глутамин (Life tech, кат. 25030024), 1 мМ пируват натрия (Sigma-Aldrich, S8636-100ML), 10% фетальная бычья сыворотка (HyClone FBS, номер партии SZB20006, GE Healthcare Austria SV30180.03) и 10 нг / мл mLIF (предоставлено кафедрой биохимии Кембриджского университета). Их пассировали каждые 2 дня, промывая PBS (Sigma-Aldrich, D8537), добавляя 0,25% трипсин-ЭДТА (Life tech, кат. 25200072) для отделения клеток, а затем промывая в среде перед повторным посевом в свежую среду. Чтобы помочь клеткам прикрепиться к поверхности, планшеты инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в PBS, содержащем 0,1% желатина (Sigma Aldrich, G1890). Фоновые линии ES-клеток E14tg2a (доступные от Sigma Aldrich, 08021401) были охарактеризованы с помощью количественной ПЦР, RNA-seq, ChIP-seq и анализов активности, и их обычно проверяли на контаминацию микоплазмой и дали отрицательный результат.

    ES-клетки, экспрессирующие мышиный CHD4, помеченный на С-конце mEos3.2-HaloTag, генерировались путем нокаута на основе CRISPR / Cas9 кассеты, содержащей mEos3.2-HaloTag и ген селекции пуромицина в один аллель CHD4 клетки ES 37 . Затем кассету пуромицина удаляли с использованием рекомбиназы Dre для генерации аллеля CHD4 с помощью слияния mEos3.2-HaloTag на С-конце. Поскольку нокаут CHD4 является летальным, мы использовали анализы жизнеспособности клеток, чтобы убедиться, что функция меченого CHD4 не пострадала.Линия ES-клеток E14tg2a 67 , экспрессирующая mEos3.2-tagged CENP-A, была ранее описана 59 , но вкратце была создана путем трансфекции плазмиды, экспрессирующей меченый белок, с последующей селекцией в 500 мкг / мл генетицина (Life tech , кат.10131019). После 2 недель отбора генетицина клетки сортировали с использованием проточного сортировщика MoFlo (Beckman Coulter), чтобы гарантировать, что они были помечены флуорофором mEos3.2 (возбуждение при 488 нм, испускание при 515 нм). Чтобы проверить наличие одномолекулярного FRET между mEos3.2 или PA-JF 549 и JF 646 на разных белках, векторы, экспрессирующие HaloTag-tag и SNAP-tag CENP-A, были созданы путем вставки последовательности HaloTag или SNAP-тега в сайт NcoI / XhoI mEos3.2. -меченый вектор CENP-A, описанный выше 59 . Один только белок HaloTag также экспрессировался в том же векторе, что и контроль. Вектор, экспрессирующий гистон h3B с меткой SNAP, ранее был описан 45 .

    Визуализация живых клеток и фиксированных клеток млекопитающих с одной молекулой

    ES-клетки, экспрессирующие mEos3.CHD4, меченный 2-HaloTag, пассировали за 2 дня перед визуализацией на 35-миллиметровых чашках со стеклянным дном № 1.0 (MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Case) в сыворотке без фенолового красного и в условиях mLIF. Непосредственно перед визуализацией, если необходимо, клетки метили 5 мкМ лиганда HaloTag-JF 646 в течение не менее 15 минут с последующими двумя промываниями в PBS и 30-минутной инкубацией при 37 ° C в среде перед визуализацией клеток в свежая сыворотка без фенолового красного и условия LIF, содержащие 5 мМ Trolox. Флуоресцентные изображения in vivo собирали в виде видеороликов из 10 000 кадров при экспозиции 500 мс.Непрерывное фотопреобразование было достигнуто с использованием лазера с длиной волны 405 нм при низкой мощности активации ~ 10 Вт / см 2 .

    Для отслеживания белкового комплекса ES-клетки, экспрессирующие SNAP-меченный гистон h3B или mEos3.2-, HaloTag- и SNAP-меченный CENP-A, были созданы путем трансфекции соответствующих экспрессионных векторов. Четыре микролитра Lipofectamine® 2000 (Life tech, каталожный 11668027), инкубированных в 100 мкл OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium (Thermo Fisher Scientific, каталожный 31985070) в течение 5 минут, добавляли приблизительно к 2–3 мкг раствора. векторы экспрессии, также инкубированные в 100 мкл OPTI-MEM® в течение 5 мин.Затем смесь инкубировали еще в течение 15 мин перед добавлением к ES-клеткам, которые одновременно пассировали на чашки со стеклянным дном 35 мм. Через 2 дня клетки метили с использованием соответствующих лигандов HaloTag, как описано выше для CHD4. Лиганды меток SNAP также были помечены аналогичным образом, но с начальной инкубацией в течение 30 минут до промывки.

    FRET был оптимизирован за счет обеспечения избытка акцепторного красителя вокруг донора mEos3.2 или PA-JF 549 . Для FRET между mEos3.CENP-A с меткой 2 и CENP-A с меткой JF 646 , это осуществляли путем трансфекции 0,4 мкг CENP-A с меткой mEos3.2 или CENP-A с меткой SNAP вместе с 2 мкг CENP-A с меткой HaloTag. А. Для FRET между PA-JF 549 -меткой и JF 646 -тегированным CENP-A или PA-JF 549 -тегом и JF 646 -тегированным h3B это было достигнуто путем мечения клеток после трансфекции с 0,2 µM SNAP-tag PA-JF 549 лиганд и 2 µM SNAP-tag JF 646 лиганд. Наконец, для CENP-A / h3B FRET — 1 мкг mEos3.2-меченый CENP-A трансфицировали вместе с 1 мкг SNAP-меченного CENP-A и метили 5 мкМ SNAP-tag JF 646 лигандом. Клетки, экспрессирующие конструкцию mEos3.2-CENPA, PA-JF 549 -CENP-A или PA-JF 549 -h3B, были идентифицированы по их способности фотоактивировать отдельные молекулы с использованием лазера 405 нм и клеток, помеченных лиганды HaloTag-JF 646 или SNAP tag JF 646 по их локализации в центромерных фокусах или в ядре (для HaloTag-CENP-A или h3B с меткой SNAP, соответственно), как определено путем визуализации с использованием лазера с длиной волны 641 нм. (1 кВт / см 2 ).Флуоресцентные изображения фиксированных и живых клеток собирали в виде видеофильмов размером от 3000 до 5000 кадров при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование достигалось с использованием 100 мс экспозиции лазера 405 нм каждые 6 с при низкой мощности активации ~ 10 Вт / см 2 . Для фиксации клеток клетки промывали PBS, фиксировали при комнатной температуре в PBS, содержащем 4% формальдегид, в течение 15 минут, снова промывали в PBS и затем ресуспендировали в PBS, содержащем 5 мМ Trolox.

    Обработка и анализ изображений клеток млекопитающих

    Фильмы о живых клетках и неподвижных клетках с одиночными молекулами были проанализированы с использованием программного обеспечения Rapidstorm, которое определяет локализации одиночных молекул из фильмов PALM 68 , после использования коррекции фона катящегося шара изображения с радиусом 5 пикселей.Были проанализированы только флуоресцентные точки шириной менее 5 или 3 пикселей (для микроскопов 1 и 2 соответственно) и с фиксированным глобальным порогом выше 25000. Чтобы отслеживать отдельные молекулы CHD4, CENP-A или h3B, мы использовали специальный код для соединения локализаций отдельных молекул и извлечения длины их траекторий (сценарий можно найти на https://github.com/TheLaueLab/trajectory-analysis) . Флуоресцентные точки считались одной и той же молекулой, если они находились в пределах 100 нм между кадрами, потому что мы не ожидаем увидеть более высокие коэффициенты диффузии для связанного h3B / CENP-A / CHD4.Молекулы все еще были связаны, если они не были обнаружены в течение 1 кадра, чтобы уменьшить вероятность того, что молекулы на короткое время упадут ниже порога отношения сигнал-шум. Траектории меньше трех локализаций отбрасываются, чтобы снизить вероятность обнаружения шума. Средняя интенсивность этих траекторий также была извлечена для расчетов эффективности FRET — мы игнорируем первый и последний кадры, потому что молекула могла не флуоресцировать на всех этих кадрах. Изображения одиночных молекул, представленные на рис.4 были сгенерированы с использованием Peak Fit, так что локализации представляют точность, с которой они были локализованы 69 . Точность локализации была рассчитана после анализа Rapidstorm путем подбора гистограммы парных расстояний до ближайших соседей 70 .

    Для отслеживания живых клеток односвязанных молекул CHD4 эксперимент был воспроизведен дважды на Микроскопе 1 и один раз на Микроскопе 2. Мы снова решили проанализировать наборы данных с Микроскопа 1, записанные в тот же день, чтобы уменьшить систематические ошибки, возникающие из-за незначительно отличающихся друг от друга микроскопов. выравнивания.Мы собрали 772 и 539 траекторий одиночных молекул из фильмов одиночных молекул, содержащих mEos3.2- и mEos3.2-JF 646 -меченых молекул CHD4, соответственно (обычно в каждом фильме изучались две клетки). Учитывая, что 10–30% отдельных молекул mEos3.2 – JF 646 находились во включенном состоянии дольше, чем отдельные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки, чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения.

    Для анализа близости белка FRET CENP-A было собрано больше траекторий, потому что mEos3 относительно мало.Предполагалось, что молекулы с двумя метками будут находиться рядом с молекулами с меткой JF 646 . Эксперимент был воспроизведен один раз на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных из Микроскопа 2, в котором мы собрали 17 953, 17 288 и 21 018 траекторий из одномолекулярных фильмов mEos3.2-CENP-A, mEos3. .2-CENP-A / JF 646 -CENPA и mEos3.2-CENP-A / JF 646 -h3B, соответственно (обычно в каждом фильме изучались четыре клетки). Учитывая, что ~ 0,1–1% mEos3.2 молекулы в присутствии помеченных JF 646 молекул находились во включенном состоянии дольше, чем отдельные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки, чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения.

    Для анализа близости h3B FRET эксперимент был воспроизведен дважды на микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных, в которых мы собрали 2114 и 3970 траекторий из фильмов с одной молекулой PA-JF 549 -h3B и PA-JF. 549 -h3b / JF 646 -h3B соответственно (обычно в каждом фильме изучались четыре клетки).Учитывая, что 10% молекул PA-JF 549 в присутствии молекул с меткой JF 646 находились во включенном состоянии более 1% от одиночных молекул PA-JF 549 , это подходящий размер образца. чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения. Траектории длиннее 1% одиночных молекул PA-JF 549 были идентифицированы и окрашены в синий цвет. Эффективность FRET рассчитывалась с использованием средней интенсивности молекул, меченных одним PA-JF 549 . Карты плотности шириной 2 пикселя (312 нм) были созданы, чтобы показать количество молекул, обнаруженных в пределах области, и была ли средняя длина трека ниже (желтый) или выше 12 с (синий), с доверительным интервалом 1%, установленным таким образом, что существует 1% -ная вероятность того, что молекулы, помеченные PA-JF 549 , имеют длину трека более 12 с.

    Доступность данных

    Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у авторов по запросу.

    Add a comment

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    Химия / Метод Реактивная группа Ремарк
    ДНК / РНК метилированный ацетоспирт

    (ACE) синтез твердой подложки

    Прямое включение в основную цепь
    Реакционноспособный с амином (-NH 2 ) сложный эфир сукцинимидил (NHS) Амино C6- dT / dC (для внутренней маркировки без разрушения остова )
    Тиолореактивный (-SH) Малеимид Тиоловый модификатор на 3′- или 5′-конце
    Белки
    Аминно-реактивный (NHS) сложный эфир N-концевая группа или аминогруппа лизина a
    Тиолореактивный (-SH) 9 0391

    Малеимид Тиоловая группа цистеина b
    Реакционноспособный кетон (= CO) Гидразин Неестественная аминокислота с кетонной группой c