6R 9996: Мобильный Код 9996 — Определить Оператора Связи, Регион и Город у Телефонов, Начинающихся на 9996

Фильтры и заправочные емкости, интервалы замен

Нажмите на интересующую вас модель для получения информации:

о перечне фильтров для выбранной спецтехники,         об интервалах технического обслуживания,    и заправочных емкостях

Таблица Брадиса sin cos tg ctg

Калькулятор поможет рассчитать точные значения тригонометрических функций sin, cos, tg и ctg для различных значений углов в градусах или радианах.

На данной странице таблица Брадиса, которая дает значение sin, cos, tg, ctg любого острого угла, содержащего целое число градусов и десятых долей градуса.
Для нахождения значения угла берется число на пересечении строки, которое соответствует числу градусов и столбца, которое соответствует числу минут. Например, sin 70°30′ = 0.9426.

Найти точное значение

Таблица Брадиса sin, cos

sin	0′	6′	12′	18′	24′	30′	36′	42′	48′	54′	60′		1′	2′	3′
	60′	54′	48′	42′	36′	30′	24′	18′	12′	6′	0′	cos
											0	90°
0°	0,0000	0017	0035	0052	0070	0087	0105	0122	0140	0157	0175	89°	3	6	9
1°	0175	0192	0209	0227	0244	0262	0279	0297	0314	0332	0349	88°	3	6	9
2°	0349	0366	0384	0401	0419	0436	0454	0471	0488	0506	0523	87°	3	6	9
3°	0523	0541	0558	0576	0593	0610	0628	0645	0663	0680	0698	86°	3	6	9
4°	0698	0715	0732	0750	0767	0785	0802	0819	0837	0854	0872	85°	3	6	9
5°	0872	0889	0906	0924	0941	0958	0976	0993	1011	1028	1045	84°	3	6	9
6°	1045	1063	1080	1097	1115	1132	1149	1167	1184	1201	1219	83°	3	6	9
7°	1219	1236	1253	1271	1288	1305	1323	1340	1357	1374	1392	82°	3	6	9
8°	1392	1409	1426	1444	1461	1478	1495	1513	1530	1547	1564	81°	3	6	9
9°	1564	1582	1599	1616	1633	1650	1668	1685	1702	1719	1736	80°	3	6	9
10°	1736	1754	1771	1788	1805	1822	1840	1857	1874	1891	1908	79°	3	6	9
11°	1908	1925	1942	1959	1977	1994	2011	2028	2045	2062	2079	78°	3	6	9
12°	2079	2096	2113	2130	2147	2164	2181	2198	2215	2233	2250	77°	3	6	9
13°	2250	2267	2284	2300	2317	2334	2351	2368	2385	2402	2419	76°	3	6	8
14°	2419	2436	2453	2470	2487	2504	2521	2538	2554	2571	2588	75°	3	6	8
15°	2588	2605	2622	2639	2656	2672	2689	2706	2723	2740	2756	74°	3	6	8
sin	0′	6′	12′	18′	24′	30′	36′	42′	48′	54′	60′		1′	2′	3′
	60′	54′	48′	42′	36′	30′	24′	18′	12′	6′	0′	cos
16°	2756	2773	2790	2807	2823	2840	2857	2874	2890	2907	2924	73°	3	6	8
17°	2924	2940	2957	2974	2990	3007	3024	3040	3057	3074	3090	72°	3	6	8
18°	3090	3107	3123	3140	3156	3173	3190	3206	3223	3239	3256	71°	3	6	8
19°	3256	3272	3289	3305	3322	3338	3355	3371	3387	3404	3420	70°	3	5	8
20°	3420	3437	3453	3469	3486	3502	3518	3535	3551	3567	3584	69°	3	5	8
21°	3584	3600	3616	3633	3649	3665	3681	3697	3714	3730	3746	68°	3	5	8
22°	3746	3762	3778	3795	3811	3827	3843	3859	3875	3891	3907	67°	3	5	8
23°	3907	3923	3939	3955	3971	3987	4003	4019	4035	4051	4067	66°	3	5	8
24°	4067	4083	4099	4115	4131	4147	4163	4179	4195	4210	4226	65°	3	5	8
25°	4226	4242	4258	4274	4289	4305	4321	4337	4352	4368	4384	64°	3	5	8
26°	4384	4399	4415	4431	4446	4462	4478	4493	4509	4524	4540	63°	3	5	8
27°	4540	4555	4571	4586	4602	4617	4633	4648	4664	4679	4695	62°	3	5	8
28°	4695	4710	4726	4741	4756	4772	4787	4802	4818	4833	4848	61°	3	5	8
29°	4848	4863	4879	4894	4909	4924	4939	4955	4970	4985	5000	60°	3	5	8
30°	5000	5015	5030	5045	5060	5075	5090	5105	5120	5135	5150	59°	3	5	8
sin	0′	6′	12′	18′	24′	30′	36′	42′	48′	54′	60′		1′	2′	3′
	60′	54′	48′	42′	36′	30′	24′	18′	12′	6′	0′	cos
31°	5150	5165	5180	5195	5210	5225	5240	5255	5270	5284	5299	58°	2	5	7
32°	5299	5314	5329	5344	5358	5373	5388	5402	5417	5432	5446	57°	2	5	7
33°	5446	5461	5476	5490	5505	5519	5534	5548	5563	5577	5592	56°	2	5	7
34°	5592	5606	5621	5635	5650	5664	5678	5693	5707	5721	5736	55°	2	5	7
35°	5736	5750	5764	5779	5793	5807	5821	5835	5850	5864	5878	54°	2	5	7
36°	5878	5892	5906	5920	5934	5948	5962	5976	5990	6004	6018	53°	2	5	7
37°	6018	6032	6046	6060	6074	6088	6101	6115	6129	6143	6157	52°	2	5	7
38°	6157	6170	6184	6198	6211	6225	6239	6252	6266	6280	6293	51°	2	5	7
39°	6293	6307	6320	6334	6347	6361	6374	6388	6401	6414	6428	50°	2	4	7
40°	6428	6441	6455	6468	6481	6494	6508	6521	6534	6547	6561	49°	2	4	7
41°	6561	6574	6587	6600	6613	6626	6639	6652	6665	6678	6691	48°	2	4	7
42°	6691	6704	6717	6730	6743	6756	6769	6782	6794	6807	6820	47°	2	4	6
43°	6820	6833	6845	6858	6871	6884	6896	6909	6921	6934	6947	46°	2	4	6
44°	6947	6959	6972	6984	6997	7009	7022	7034	7046	7059	7071	45°	2	4	6
45°	7071	7083	7096	7108	7120	7133	7145	7157	7169	7181	7193	44°	2	4	6
sin	0′	6′	12′	18′	24′	30′	36′	42′	48′	54′	60′		1′	2′	3′
	60′	54′	48′	42′	36′	30′	24′	18′	12′	6′	0′	cos
46°	7193	7206	7218	7230	7242	7254	7266	7278	7290	7302	7314	43°	2	4	6
47°	7314	7325	7337	7349	7361	7373	7385	7396	7408	7420	7431	42°	2	4	6
48°	7431	7443	7455	7466	7478	7490	7501	7513	7524	7536	7547	41°	2	4	6
49°	7547	7559	7570	7581	7593	7604	7615	7627	7638	7649	7660	40°	2	4	6
50°	7660	7672	7683	7694	7705	7716	7727	7738	7749	7760	7771	39°	2	4	6
51°	7771	7782	7793	7804	7815	7826	7837	7848	7859	7869	7880	38°	2	4	5
52°	7880	7891	7902	7912	7923	7934	7944	7955	7965	7976	7986	37°	2	4	5
53°	7986	7997	8007	8018	8028	8039	8049	8059	8070	8080	8090	36°	2	3	5
54°	8090	8100	8111	8121	8131	8141	8151	8161	8171	8181	8192	35°	2	3	5
55°	8192	8202	8211	8221	8231	8241	8251	8261	8271	8281	8290	34°	2	3	5
56°	8290	8300	8310	8320	8329	8339	8348	8358	8368	8377	8387	33°	2	3	5
57°	8387	8396	8406	8415	8425	8434	8443	8453	8462	8471	8480	32°	2	3	5
58°	8480	8490	8499	8508	8517	8526	8536	8545	8554	8563	8572	31°	2	3	5
59°	8572	8581	8590	8599	8607	8616	8625	8634	8643	8652	8660	30°	1	3	4
60°	8660	8669	8678	8686	8695	8704	8712	8721	8729	8738	8746	29°	1	3	4
sin	0′	6′	12′	18′	24′	30′	36′	42′	48′	54′	60′		1′	2′	3′
	60′	54′	48′	42′	36′	30′	24′	18′	12′	6′	0′	cos
61°	8746	8755	8763	8771	8780	8788	8796	8805	8813	8821	8829	28°	1	3	4
62°	8829	8838	8846	8854	8862	8870	8878	8886	8894	8902	8910	27°	1	3	4
63°	8910	8918	8926	8934	8942	8949	8957	8965	8973	8980	8988	26°	1	3	4
64°	8988	8996	9003	9011	9018	9026	9033	9041	9048	9056	9063	25°	1	3	4
65°	9063	9070	9078	9085	9092	9100	9107	9114	9121	9128	9135	24°	1	2	4
66°	9135	9143	9150	9157	9164	9171	9178	9184	9191	9198	9205	23°	1	2	3
67°	9205	9212	9219	9225	9232	9239	9245	9252	9259	9265	9272	22°	1	2	3
68°	9272	9278	9285	9291	9298	9304	9311	9317	9323	9330	9336	21°	1	2	3
69°	9336	9342	9348	9354	9361	9367	9373	9379	9385	9391	9397	20°	1	2	3
70°	9397	9403	9409	9415	9421	9426	9432	9438	9444	9449	9455	19°	1	2	3
71°	9455	9461	9466	9472	9478	9483	9489	9494	9500	9505	9511	18°	1	2	3
72°	9511	9516	9521	9527	9532	9537	9542	9548	9553	9558	9563	17°	1	2	3
73°	9563	9568	9573	9578	9583	9588	9593	9598	9603	9608	9613	16°	1	2	2
74°	9613	9617	9622	9627	9632	9636	9641	9646	9650	9655	9659	15°	1	2	2
75°	9659	9664	9668	9673	9677	9681	9686	9690	9694	9699	9703	14°	1	1	2
sin	0′	6′	12′	18′	24′	30′	36′	42′	48′	54′	60′		1′	2′	3′
	60′	54′	48′	42′	36′	30′	24′	18′	12′	6′	0′	cos
76°	9703	9707	9711	9715	9720	9724	9728	9732	9736	9740	9744	13°	1	1	2
77°	9744	9748	9751	9755	9759	9763	9767	9770	9774	9778	9781	12°	1	1	2
78°	9781	9785	9789	9792	9796	9799	9803	9806	9810	9813	9816	11°	1	1	2
79°	9816	9820	9823	9826	9829	9833	9836	9839	9842	9845	9848	10°	1	1	2
80°	9848	9851	9854	9857	9860	9863	9866	9869	9871	9874	9877	9°	0	1	1
81°	9877	9880	9882	9885	9888	9890	9893	9895	9898	9900	9903	8°	0	1	1
82°	9903	9905	9907	9910	9912	9914	9917	9919	9921	9923	9925	7°	0	1	1
83°	9925	9928	9930	9932	9934	9936	9938	9940	9942	9943	9945	6°	0	1	1
84°	9945	9947	9949	9951	9952	9954	9956	9957	9959	9960	9962	5°	0	1	1
85°	9962	9963	9965	9966	9968	9969	9971	9972	9973	9974	9976	4°	0	0	1
86°	9976	9977	9978	9979	9980	9981	9982	9983	9984	9985	9986	3°	0	0	0
87°	9986	9987	9988	9989	9990	9990	9991	9992	9993	9993	9994	2°	0	0	0
88°	9994	9995	9995	9996	9996	9997	9997	9997	9998	9998	9998	1°	0	0	0
89°	9998	9999	9999	9999	9999	1. 0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	0°	0	0	0
90°	1
sin	0′	6′	12′	18′	24′	30′	36′	42′	48′	54′	60′		1′	2′	3′
	60′	54′	48′	42′	36′	30′	24′	18′	12′	6′	0′	cos

Таблица Брадиса tg, ctg

Дешевые авиабилеты Новосибирск — Нерюнгри — цены на билеты на самолет, расписание рейсов, оплата онлайн

Авиакомпания	Рейс	Самолет	Регулярность	Вылет	Прилет	Время в пути	Поиск
Авиакомпания	Рейс	Самолет	Регулярность	Вылет	Прилет	Время в пути	Поиск
S7 Airlines	S7 5247		только 19, 26 марта	01:15:00, Толмачёво	07:00:00, Чульман	~ 3 ч. 55 мин.	Найти
S7 Airlines	S7 5245	Boeing 737-800	вт, чт, сб по 27.03	02:15:00, Толмачёво	08:00:00, Чульман	~ 3 ч. 55 мин.	Найти
S7 Airlines	S7 5245		вт, чт, пт, сб с 30.03 по 31.07	02:30:00, Толмачёво	08:10:00, Чульман	~ 3 ч. 45 мин.	Найти
Якутия	R3 483	Сухой Суперджет 100	пт по 26.03	08:30:00, Толмачёво	14:00:00, Чульман	~ 3 ч. 15 мин.	Найти
Алроса	6R 4483	Сухой Суперджет 100	пт по 26. 03	08:30:00, Толмачёво	14:00:00, Чульман	~ 3 ч. 15 мин.	Найти
Якутия	R3 483	Сухой Суперджет 100	пн, пт с 29.03 по 30.04	12:25:00, Толмачёво	18:05:00, Чульман	~ 3 ч. 45 мин.	Найти
Якутия	R3 483	Сухой Суперджет 100	только 15, 22 февраля, 1, 8, 15, 22 марта	12:25:00, Толмачёво	17:50:00, Чульман	~ 3 ч. 30 мин.	Найти
Алроса	6R 4483	Сухой Суперджет 100	только 15, 22 февраля, 1, 8, 15, 22 марта	12:25:00, Толмачёво	17:50:00, Чульман	~ 3 ч. 30 мин.	Найти

31 «+ ВЕДУЩИЙ 4GAUGE TOP POST, ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ / ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КАБЕЛЬ АККУМУЛЯТОРА USA MADE BY POWER PATH.10.3 * rainbowlands.lk

31 «+ ВЕРХНИЙ ШТЫРЬ 4GAUGE, ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ / ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КАБЕЛЬ АККУМУЛЯТОРА USA MADE BY POWER PATH.10.3 * rainbowlands.lk

1. Home
2. Автозапчасти и транспортные средства
3. Автозапчасти и аксессуары
4. Запчасти для легковых и грузовых автомобилей
5. Системы зарядки и запуска для легковых и грузовых автомобилей
6. org/Breadcrumb»> Системы зарядки и запуска для других легковых и грузовых автомобилей
7. 31 «+ LEAD 4GAUGE TOP POST , ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ / ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КАБЕЛЬ АККУМУЛЯТОРНОЙ БАТАРЕИ, США, ИЗГОТОВЛЕННЫЙ ПИТАНИЕМ.10.3 *

Автозапчасти и транспортные средства Автозапчасти и аксессуары Запчасти для легковых и грузовых автомобилей Системы зарядки и запуска для легковых и грузовых автомобилей Другие системы зарядки и запуска для других легковых и грузовых автомобилей 31 «+ LEAD 4GAUGE TOP POST, POS / ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КАБЕЛЬ АККУМУЛЯТОРА USA MADE BY POWER ПУТЬ.10.3 *

ВЕРХНИЙ ШТОК 4GAUGE 31 «+, КАБЕЛЬ ДЛЯ ПИТАНИЯ США / ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КАБЕЛЬ USA MADE BY POWER PATH 10.3 *, 31» + ВЫВОД 4GAUGE TOP POST, ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ / ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КАБЕЛЬ ДЛЯ БАТАРЕИ USA MADE BY POWER PATH.10.3 *, 10,3, КАБЕЛЬ МЕДНАЯ ИЛИ ЛУНОВЕННАЯ ПРОКЛАДКА ДВОЙНО ОБЖАТА.ПУТЬ ПИТАНИЯ. 10.3 * 31 «+ ВЕРХНИЙ ШТЫРЬ 4GAUGE, ПОЗ. / ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КАБЕЛЬ АККУМУЛЯТОРНОЙ БАТАРЕИ, ПРОИЗВОДСТВО США.

31 «+ ВЕДУЩИЙ 4GAUGE TOP POST, POS / ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КАБЕЛЬ АККУМУЛЯТОРНОЙ БАТАРЕИ USA MADE BY POWER PATH.10.3 *. КАБЕЛЬНАЯ МЕДНАЯ ИЛИ ЛУЖОВАЯ ПРОКЛАДКА ДВОЙНО ОБЖАТЫ.10.3 .. Состояние: Новое ： Страна / регион производства: ： США ， Гарантия: ： Нет ： Номер детали производителя: ： 713114 ， Страна производства: ： США ： Бренд: ： POWER PATH ，。

31 «+ ВЕДУЩИЙ ВЕРХНИЙ ШТЫРЬ 4GAUGE, ПОЗИЦИОННЫЙ / ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КАБЕЛЬ АККУМУЛЯТОРНОЙ БАТАРЕИ USA MADE BY POWER PATH.10,3 *

ВЕРХНИЙ ШТЫРЬ 4GAUGE 31 «+, КАБЕЛЬ ДЛЯ ПИТАНИЯ США / ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КАБЕЛЬ USA MADE BY POWER PATH 10.3 *, 31» + ВВЕДЕНИЕ 4GAUGE TOP POST, ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ / ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КАБЕЛЬ АККУМУЛЯТОРА USA MADE BY POWER PATH.10.3 *

Bare by Solo 6R-2050 Eco-Forward 6 унций. Свернутая белой бумагой чашка конуса бумаги обода с упаковкой коробки макулатурного картона

% PDF-1.7
%
1273 0 объект
>
endobj

xref
1273 314
0000000016 00000 н.
0000019670 00000 п.
0000019739 00000 п.
0000020085 00000 п.
0000020274 00000 п.
0000020450 00000 п.
0000020626 00000 п.
0000020817 00000 п.
0000020988 00000 п.
0000021195 00000 п.
0000021397 00000 п.
0000021587 00000 п.
0000021759 00000 п.
0000021944 00000 п.
0000022104 00000 п.
0000022327 00000 п.
0000022512 00000 п.
0000022681 00000 п.
0000022866 00000 п.
0000023097 00000 п.
0000023268 00000 н.
0000023473 00000 п.
0000023677 00000 п.
0000023873 00000 п.
0000024082 00000 п.
0000024283 00000 п.
0000024445 00000 п.
0000024606 00000 п.
0000024860 00000 п.
0000025102 00000 п.
0000025303 00000 п.
0000025491 00000 п.
0000025705 00000 п.
0000025884 00000 п.
0000026096 00000 п.
0000026279 00000 п.
0000026440 00000 п.
0000026629 00000 н.
0000026817 00000 п.
0000027015 00000 п.
0000027220 00000 н.
0000027427 00000 н.
0000027701 00000 п.
0000027893 00000 п.
0000028139 00000 п.
0000028301 00000 п.
0000028559 00000 п.
0000028680 00000 п.
0000028724 00000 п.
0000029071 00000 п.
0000029175 00000 п.
0000030021 00000 п.
0000030172 00000 п.
0000030389 00000 п.
0000030602 00000 п.
0000030818 00000 п.
0000031025 00000 п.
0000031232 00000 п.
0000031469 00000 п.
0000031706 00000 п.
0000031872 00000 п.
0000032074 00000 п.
0000032262 00000 п.
0000032412 00000 п.
0000032566 00000 п.
0000032733 00000 п.
0000032901 00000 п.
0000033111 00000 п.
0000033321 00000 п.
0000033490 00000 п.
0000033671 00000 п.
0000033860 00000 п.
0000034052 00000 п.
0000034255 00000 п.
0000034485 00000 п.
0000034529 00000 п.
0000034843 00000 п.
0000035304 00000 п.
0000035787 00000 п.
0000036314 00000 п.
0000036780 00000 п.
0000037247 00000 п.
0000037464 00000 п.
0000037711 00000 п.
0000037921 00000 п.
0000038140 00000 п.
0000038343 00000 п.
0000038587 00000 п.
0000038760 00000 п.
0000038924 00000 п.
0000039111 00000 п.
0000039339 00000 п.
0000039576 00000 п.
0000039772 00000 п.
0000040043 00000 п.
0000040279 00000 п.
0000040518 00000 п.
0000040711 00000 п.
0000040918 00000 п.
0000041150 00000 п.
0000041381 00000 п.
0000041595 00000 п.
0000041840 00000 п.
0000042071 00000 п.
0000042227 00000 н.
0000042392 00000 п.
0000042620 00000 п.
0000045191 00000 п.
0000045358 00000 п.
0000045698 00000 п.
0000045934 00000 п.
0000046084 00000 п.
0000046304 00000 п.
0000046516 00000 п.
0000046748 00000 н.
0000046983 00000 п.
0000047126 00000 п.
0000047170 00000 п.
0000047511 00000 п.
0000047993 00000 п.
0000048192 00000 п.
0000048384 00000 п.
0000048594 00000 п.
0000048776 00000 п.
0000048993 00000 п.
0000049206 00000 п.
0000049409 00000 п.
0000049635 00000 п.
0000049823 00000 п.
0000050021 00000 п.
0000050243 00000 п.
0000050468 00000 п.
0000050685 00000 п.
0000050910 00000 п.
0000051106 00000 п.
0000051308 00000 п.
0000051556 00000 п.
0000051828 00000 п.
0000052029 00000 п.
0000052244 00000 п.
0000052444 00000 п.
0000052612 00000 п.
0000052786 00000 п.
0000052973 00000 п.
0000053140 00000 п.
0000053343 00000 п.
0000053540 00000 п.
0000053722 00000 п.
0000053894 00000 п.
0000054081 00000 п.
0000054238 00000 п.
0000054450 00000 п.
0000054616 00000 п.
0000054795 00000 п.
0000055019 00000 п.
0000055185 00000 п.
0000055369 00000 п.
0000055563 00000 п.
0000055745 00000 п.
0000055940 00000 п.
0000056135 00000 п.
0000056352 00000 п.
0000056586 00000 п.
0000056921 00000 п.
0000056965 00000 п.
0000057088 00000 п.
0000057562 00000 п.
0000057764 00000 п.
0000058266 00000 п.
0000058560 00000 п.
0000058812 00000 п.
0000059012 00000 н.
0000059217 00000 п.
0000059419 00000 п.
0000059641 00000 п.
0000059827 00000 п.
0000060050 00000 п.
0000060270 00000 п.
0000060459 00000 п.
0000060687 00000 п.
0000061277 00000 п.
0000061486 00000 п.
0000061689 00000 п.
0000061897 00000 п.
0000062084 00000 п.
0000062296 00000 п.
0000062487 00000 п.
0000062531 00000 п.
0000062889 00000 п.
0000062956 00000 п.
0000063141 00000 п.
0000063329 00000 п.
0000063522 00000 п.
0000063683 00000 п.
0000063745 00000 п.
0000063789 00000 п.
0000063974 00000 п.
0000064243 00000 п.
0000064470 00000 п.
0000064684 00000 п.
0000064884 00000 п.
0000065076 00000 п.
0000065283 00000 п.
0000065470 00000 п.
0000065687 00000 п.
0000065897 00000 п.
0000066097 00000 п.
0000066315 00000 п.
0000066550 00000 п.
0000066762 00000 п.
0000066950 00000 п.
0000067170 00000 п.
0000067379 00000 п.
0000067562 00000 п.
0000067721 00000 п.
0000067885 00000 п.
0000068116 00000 п.
0000068306 00000 п.
0000068506 00000 п.
0000068702 00000 п.
0000068916 00000 п.
0000069127 00000 п.
0000069338 00000 п.
0000069542 00000 п.
0000069751 00000 п.
0000069955 00000 п.
0000070167 00000 п.
0000070313 00000 п.
0000070465 00000 п.
0000070628 00000 п.
0000070829 00000 п.
0000071031 00000 п.
0000071284 00000 п.
0000071644 00000 п.
0000071688 00000 п.
0000071824 00000 п.
0000072125 00000 п.
0000072466 00000 п.
0000072629 00000 п.
0000072960 00000 п.
0000073280 00000 п.
0000073577 00000 п.
0000073796 00000 п.
0000074061 00000 п.
0000074311 00000 п.
0000074565 00000 п.
0000074780 00000 п.
0000074977 00000 п.
0000075149 00000 п.
0000075403 00000 п.
0000075621 00000 п.
0000075870 00000 п.
0000076132 00000 п.
0000076344 00000 п.
0000076603 00000 п.
0000076819 00000 п.
0000077032 00000 п.
0000077300 00000 п.
0000077565 00000 п.
0000077921 00000 п.
0000077965 00000 п.
0000078085 00000 п.
0000078236 00000 п.
0000078539 00000 п.
0000078823 00000 п.
0000079084 00000 п.
0000079337 00000 п.
0000079693 00000 п.
0000079931 00000 н.
0000080164 00000 п.
0000080399 00000 п.
0000080666 00000 п.
0000080898 00000 п.
0000081153 00000 п.
0000081389 00000 п.
0000081627 00000 п.
0000081900 00000 п.
0000082088 00000 п.
0000082436 00000 п.
0000082480 00000 п.
0000082627 00000 п.
0000082791 00000 н.
0000083017 00000 п.
0000083261 00000 п.
0000083471 00000 п.
0000083686 00000 п.
0000083942 00000 п.
0000084201 00000 п.
0000084439 00000 п.
0000084675 00000 п.
0000084905 00000 п.
0000085080 00000 п.
0000085340 00000 п.
0000085543 00000 п.
0000085759 00000 п.
0000085960 00000 п.
0000086172 00000 п.
0000086390 00000 п.
0000086570 00000 п.
0000086827 00000 н.
0000086984 00000 п.
0000087211 00000 п.
0000087362 00000 п.
0000087556 00000 п.
0000087733 00000 п.
0000087942 00000 п.
0000088160 00000 п.
0000088332 00000 п.
0000088552 00000 п.
0000088734 00000 п.
0000088907 00000 н.
0000089114 00000 п.
0000089355 00000 п.
0000006576 00000 н.
трейлер
] >>
startxref
0
%% EOF

1586 0 объект
> поток
xTS? |! * ޕ. M
MD
ņACNZE
8A6E83 {Zuaq ~ d

John Deere iGrade ™ Precision Agriculture

Интегрированные комплекты машин AutoTrac

Комплект комбайна AutoTrac — серия 50 (PIN 695101 и выше) — PF

Комплект комбайна AutoTrac — серия 60 — PF

Комплект комбайна AutoTrac — серия 70 — PF

Электрический разъем AutoTrac в сборе — модели 7020 или 7015 — PF

Комплект опрыскивателя AutoTrac — модели 4700 — PF

Комплект опрыскивателя AutoTrac — модели 4710 (PIN 003999 и ниже) — PF

Комплект опрыскивателя AutoTrac — модели 4710 (PIN 004000 и выше) — PF

Комплект опрыскивателя AutoTrac — модели 4720 — PF

Комплект опрыскивателя AutoTrac — модели 4730 или 4830 — PF

Комплект опрыскивателя AutoTrac — модели 4920 (PIN 004000 и выше) или модели 4930 — PF

Комплект опрыскивателя AutoTrac — модели 4920 (PIN 003999 и ниже) — PF

Комплект шкворня для трактора AutoTrac — модели 6105R, 6115R, 6125R или 6130R (IT4) с MFWD — BPF10616

Комплект шкворня для трактора AutoTrac — модели 6140R или 6150R с MFWD — BPF10560

Комплект трактора AutoTrac — серия 6030 или 7030 Premium с MFWD — BPF10039

Комплект трактора AutoTrac — модели 6105R, 6115R или 6125R с MFWD — BPF10513

Комплект трактора AutoTrac — модели 6130R (FT4), 6120R, 6110R с MFWD — BPF10989

Комплект трактора AutoTrac — модель 6135R с MFWD — BPF10987

Комплект трактора AutoTrac — модели 6140R или 6150R с MFWD — BPF10387

Комплект трактора AutoTrac — модели 6145R, 6155R с MFWD — BPF10985

Комплект трактора AutoTrac — модели 6170R, 6190R или 6210R с MFWD — BPF10345

Комплект трактора AutoTrac — модели 6175R, 6195R и 6215R с MFWD — BPF10683

Комплект трактора AutoTrac — модели 6420 с MFWD — PF

Комплект трактора AutoTrac — модели 7020 или 7015 с MFWD — PF

Комплект трактора AutoTrac — модели 7220 или 7320 с MFWD — PF

Комплект трактора AutoTrac — модели 7420 или 7520 с MFWD — PF

Комплект трактора AutoTrac — модели 7630, 7730, 7830 или 7930 с MFWD — PF

Комплект тракторной машины AutoTrac — модели 7720 или 7820 с MFWD и
Трансмиссия IVT — PF

Комплект тракторной машины AutoTrac — модели 7720 или 7820 с MFWD и
Трансмиссия PowrQuad — PF

Комплект трактора AutoTrac — модели 7920 с MFWD и
Трансмиссия IVT — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 8000 с MFWD — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 8000T — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 8010 с MFWD — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 8010T (все контакты) или серия 8020T
(PIN-код

0 и ниже) — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 8020 с системой ILS — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 8020 с MFWD — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 8030 с ILS 40 км / ч (PIN 005466 и ниже) — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 8030 с ILS 40 км / ч (PIN 005467 и выше) — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 8030 с MFWD (PIN 005466 и ниже) — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 8030 с MFWD (PIN 005467 и выше) — PF

Комплект трактора AutoTrac — колесо серии 9000 (PIN-код 039999 и ниже)
с МКПП — PF

Комплект трактора AutoTrac — колесо серии 9000 с
Коробка передач с ручным переключением (PIN 040000 и выше) или
Колесо серии 9020 с коробкой передач с переключением под нагрузкой (PIN 001703 и ниже)
или колесо серии 9020 со стальным поршнем (PIN 010443 и ниже) — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 9000T (PIN

0 и ниже) — PF

Комплект тракторной машины AutoTrac — серия 9000T (PIN-код

1 и выше)
или серии 9020T (PIN

1-

0) — PF

Комплект тракторной машины AutoTrac — Колесо серии 9020 со стальной направляющей
(PIN 010444 и выше) или колесо серии 9020 с литым поршнем (все PIN) — PF

Комплект трактора AutoTrac — серия 9020T (PIN

0 и ниже) — PF

Комплект трактора AutoTrac — Колесный скребковый трактор серии 9030 — PF

Комплект трактора AutoTrac — Колесный скребковый трактор серии 9R — BPF10629

Комплект трактора AutoTrac — Скребковый трактор серии 9RT — BPF10631

Базовый комплект наведения SPFH — серии 7000, 7050 и 7080 — BZ100194

Базовый комплект наведения SPFH — серии 7000, 7050 и 7080 — BZ100079

Контроллер SPFH SSU — серии 7000, 7050 и 7080 — BZ100196

Комплекты AutoTrac RowSense для механических щупов

Механические щупы AutoTrac RowSense (20 дюймов. Междурядий) — PF

Механические щупы AutoTrac RowSense (расстояние между рядами 22 дюйма) — PF

Механические щупы AutoTrac RowSense (расстояние между рядами 30 дюймов или 75 см) — PF

Механические щупы AutoTrac RowSense (расстояние между рядами 45 см) — Аргентина и Бразилия — BPF10266

Механические щупы AutoTrac RowSense (междурядье 70 см) — PF

Комплект дооснащения AutoTrac RowSense — комбайн — PF

Комплект дооснащения AutoTrac RowSense — кукурузоуборочная головка — PF

Комплекты AutoTrac RowSense для универсального датчика

Комплект AutoTrac RowSense для универсального датчика — комбайн — PF

Универсальный датчик AutoTrac RowSense — PF

Крепежное оборудование для кукурузоуборочной головки Case IH — серии 2200/2400/3200/3400 30 дюймов — PF

Крепежное оборудование для кукурузоуборочной головки Drago — вся серия 30 дюймов — PF

Крепежное оборудование для кукурузной головки Geringhoff — NorthStar или Rota Disc серии 30 дюймов — PF

Монтажное оборудование кукурузоуборочной головки John Deere — серия 600, 30 дюймов и 75 см — PF

Крепежное оборудование для кукурузоуборочной головки John Deere — серия 90, 30 дюймов (MY1994-2001) — PF

Монтажное оборудование кукурузоуборочной головки John Deere — серия 90, 30 дюймов (MY2002-2007) — PF

Универсальные дополнительные комплекты AutoTrac

Универсальный вспомогательный переключатель возобновления AutoTrac — PF

Комплект универсального ремня безопасности AutoTrac — BPF11129

Комплект универсального звукового сигнала AutoTrac — PF

Универсальная ступица AutoTrac и кронштейн, предотвращающий вращение — PF

Универсальный концентратор AutoTrac, кронштейн, предотвращающий вращение, и оборудование — PF

Универсальный концентратор AutoTrac, кронштейн с автоповоротом и комплект переключателя звукового сигнала — PF

Универсальный оригинальный кронштейн AutoTrac с прорезями для дисплея GreenStar — PF

Ремни GreenStar и Gen 4

Комплект ремней безопасности GreenStar — 6M (MY16) Кабина FT4 — BPF11333

Универсальный комплект навигации GreenStar Ready, обновляемый — John Deere или конкурирующие модели — BPF10139

Жгут — Field Doc Connect — PF

Встроенный усилитель — PF

Крышка радиостанции John Deere RTK — PF

Магнитная антенна вездехода — John Deere RTK Radio 450 — PF

• Магнитная антенна вездехода — John Deere RTK Radio 900 — PF

  Удлинительный жгут базовой станции RTK — 20 футов. — ПФ

  Комплект для преобразования RTK для установки приемника положения StarFire старого образца — PF

  Двойной жгут радиосвязи RTK — BPF10029

  Удлинитель радио RTK — 300 футов. — PF

  Удлинитель радио RTK — 50 футов. — ПФ

  Штатив RTK с этикетками — PF

  Комплект 450 универсальных базовых станций RTK — PF

  Универсальный монтажный кронштейн RTK StarFire — PF

  Комплект повторителя для радио RTK 900 — BPF10839

  Frontiers | HSV-1 модулирует экспрессию рецептора IL-6 на дендритных клетках человека

  Введение

  Благодаря своей уникальной способности эффективно примировать наивные Т-клетки, дендритные клетки (ДК) являются наиболее мощными антигенпрезентирующими клетками и, таким образом, играют решающую роль в индукции эффективных адаптивных иммунных ответов (1). Незрелые ДК (НДК) представляют собой хранителей иммунной системы, поскольку они присутствуют в большинстве всех периферических тканей, где они захватывают (чужеродные) антигены. Там iDC особенно важны для обнаружения и поглощения чужеродных антигенов, с которыми сталкивается иммунная система хозяина. Как следствие, ДК подвергаются созреванию, что приводит к фундаментальным изменениям в паттерне их поверхностной экспрессии, таким как активация костимулирующих молекул, например кластера дифференцировки (CD) 40, CD86, CD80, функционально важной молекулы CD83, главного комплекса гистосовместимости I. и II (MHC класса I и II) молекулы или хемокиновые рецепторы, такие как CCR7 и CXCR4 (1–3).Повышающая регуляция CCR7 и CXCR4 дает возможность зрелым DCs (mDCs) мигрировать по градиентам хемокинов CCL19 / CCL21 и CXCL12, соответственно, в дренирующий лимфатический узел через лимфатические пузырьки (4). В отличие от нДК, мДК теряют свою высокую способность к захвату антигена и приобретают функцию обработки и представления антигенов в контексте молекул MHC наивным Т-клеткам в дренирующих лимфатических узлах, основных местах презентации антигена (5). Благодаря этим способностям DC действуют на стыке врожденной и адаптивной иммунной системы и необходимы для индукции эффективного иммунного ответа.Следовательно, неудивительно, что некоторые патогены приобрели стратегии, препятствующие функциям DC.

  Вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) является патогенным для человека членом подсемейства α-герпесвирусов. HSV-1 содержит, общий для всех членов семейства герпесвирусов, капсид, защищающий вирусную ДНК, богатый белком слой тегумента и оболочку, которая снабжена несколькими гликопротеинами на поверхности (6). HSV-1 способен реплицироваться в нескольких видах хозяев, таких как мыши и обезьяны (7–9), а также в различных типах клеток, например.ж., фибробласты, эпителиальные клетки или иммунные клетки, такие как DC (10–12). В то время как HSV-1 эффективно реплицируется в эпителиальных клетках и, таким образом, продуцирует два разных типа частиц, зрелые тяжелые (H-) и неинфекционные легкие (L-) частицы, репликация вируса в DC зависит от их статуса созревания. В iDCs HSV-1 использует клеточную аутофагию для деградации ядерного ламина, что облегчает ядерный выход вирусных капсидов в цитоплазму и, таким образом, образование зрелых инфекционных вирионов (13).Напротив, в мДК ВПГ-1 не может завершить свой полный цикл репликации, так как деградация ядерных ламинов ингибируется внутренней блокадой аутофагического обмена, тем самым нарушая генерацию зрелых вирионов (13). Следовательно, мДК, инфицированные ВПГ-1, преимущественно выделяют неинфекционные L-частицы, у которых отсутствует капсид и, следовательно, вирусный геном. Тем не менее, L-частицы транспортируют определенные вирусные белки к неинфицированным сторонним DCs, тем самым затрудняя жизненно важные функции DC (12, 14-16).

  HSV-1 развил несколько механизмов для использования иммунной системы человека. В последние годы были описаны множественные механизмы иммунного ускользания, опосредованные HSV-1, мешающие распознаванию DC. Яркими примерами являются нарушение стимуляции собственно Т-клеток (17) и деградация CD83 (18). Эта функционально важная поверхностная молекула ингибирует деградацию молекул MHC класса II через блокировку убиквитинлигазы MARCh2, тем самым стабилизируя экспрессию MHC класса II на DC и, следовательно, стимуляцию Т-клеток (19, 20).Кроме того, HSV-1 также снижает миграционную способность mDC по отношению к специфическим для лимфоидной ткани хемокинам, таким как CCL19 или CXCL12, опосредованным снижением уровней экспрессии хемокиновых рецепторов (21). Кроме того, мДК, инфицированные ВПГ-1, демонстрируют сильно увеличенную клеточную адгезию, опосредованную усилением активности интегрина, в результате индуцированной вирусом деградации взаимодействующего с цитохезином-1 белка [CYTIP (22)].

  Сигнальный путь IL-6 играет важную роль в возникновении как про-, так и противовоспалительных реакций (23–25).Рецепторный комплекс IL-6, который передает IL-6-зависимую передачу сигналов, состоит из мембраносвязанного рецептора IL-6 α (IL6R) и двух компонентов его гликопротеина 130, передающего сигнал (gp130). Хотя gp130 повсеместно экспрессируется на всех клетках, экспрессия IL6R ограничена отдельными типами клеток, такими как гепатоциты и иммунные клетки (26, 27). В последние годы иммунные клетки, экспрессирующие IL6R, были распространены на полученные из моноцитов DC, которые также экспрессируют сигнальный преобразователь gp130 (28, 29). В мДК белок IL6R преимущественно присутствует внутриклеточно, однако рецептор также экспрессируется на плазматической мембране, где он циклически перемещается во внутриклеточные компартменты, такие как эндосомы или транс-Гольджи (29).На клетках, экспрессирующих IL6R, например DC, классический сигнальный путь индуцируется посредством связывания IL-6 с IL6R (23, 30). Напротив, на клетках, лишенных экспрессии IL6R, сигнальный путь IL-6 также может быть активирован посредством взаимодействия IL-6 с растворимой формой IL6R (sIL6R), которая димеризуется с gp130, экспонируемым на клеточной поверхности, и поэтому называется транс- сигнализация (31). Клетки, продуцирующие растворимый вариант IL6R, представляют собой, например, Т-клетки, DC и раковые клетки (28, 32, 33). Оба плеча передачи сигналов IL-6 приводят к фосфорилированию преобразователя сигнала и активатора транскрипции 3 (STAT3) с последующей его ядерной транслокацией, что, в свою очередь, приводит к активации гена-мишени, опосредующей пролиферацию клеток, дифференцировку или индукцию иммунных ответов (34).Путь передачи сигналов IL-6 является важным индуктором противовирусного иммунного ответа (35, 36) и, таким образом, часто является мишенью для нескольких вирусов, включая энтеровирус 71 или вирус гриппа A (37, 38). Однако регуляция сигнальных компонентов, то есть IL6R и STAT3, различается у разных вирусов и инфицированных типов клеток (39, 40).

  В рамках настоящего исследования мы анализируем, воздействует ли ВПГ-1 на экспрессию IL6R с помощью мДК, и показываем, что по сравнению с имитационно инфицированным контролем мДК экспрессируют пониженные уровни IL6R на непосредственно инфицированных мДК, а также на неинфицированных случайных мДК.Кроме того, наши исследования выявили новую роль L-частиц, поскольку этих неинфекционных вирусных частиц было достаточно, чтобы вызвать модуляцию IL6R на неинфицированных сторонних mDC, однако, в меньшей степени, чем H-частицы на mDC, непосредственно инфицированных HSV-1. В этом отношении мы представляем доказательства того, что вирусные белки переносятся через L-частицы от мДК, инфицированных ВПГ-1, к неинфицированным посторонним мДК, тем самым отрицательно влияя на поверхностную экспрессию IL6R.

  Материалы и методы

  Амплификация штаммов вирусов

  Штамм HSV-1 / syn 17 ⁺ / CMV-EGFP / UL43 (CMV-цитомегаловирус, EGFP-усиленный зеленый флуоресцентный белок, UL-unique long), обозначенный здесь как дикий тип (wt), был получен из лабораторного штамма HSV-1 syn 17 ⁺ (41) посредством вставки кассеты экспрессии GFP в локус UL43 генома HSV-1 (BioVex).Кассета GFP находится под контролем промотора CMV, и удаление UL43 не обязательно для репликации HSV-1 (42, 43). HSV-1-GFPΔKan-UL41, обозначаемый здесь как HSV-1 Δvhs, также содержит кассету экспрессии EGFP, вставленную в локус гена UL41, кодирующий vhs (любезно предоставленный Мартином Мессерле, Ганноверская медицинская школа, Германия). Ген UL41 кодирует белок выключения вирусного вириона-хозяина (vhs), который действует как вирусная эндорибонуклеаза и разрушает клеточные и вирусные мРНК (44, 45). Для амплификации штаммов вируса HSV-1 wt и HSV-1 Δvhs 90% конфлюэнтных клеток BHK21 в 15 флаконах для культивирования клеток T ₁₇₅ один раз промывали PBS и инфицированным HSV-1 в среде для инфицирования (RPMI 1640 (Lonza, Швейцария ), 20 мМ HEPES) с добавлением вирионов HSV-1 при множественности инфицирования (MOI) 0,01. После периода заражения в течение 1 часа на орбитальном шейкере при комнатной температуре, 20 мл среды DMEM [с добавлением 10% FCS, 2 мМ L-глутамина, 100 Ед / мл пенициллина, 100 Ед / мл стрептомицина и 1% заменимых аминокислот (100 × сток)] добавляли в колбу для культивирования клеток, и затем клетки инкубировали при 37 ° C и 5% CO ₂ .Через четыре дня после заражения супернатанты, содержащие частицы HSV-1, отделяли от клеточного дебриса центрифугированием при 2575 × g при 4 ° C в течение 10 минут. После этого супернатанты переносили в пробирки для высокоскоростного центрифугирования и центрифугировали при 39,742 × g при 4 ° C в течение 2 часов. Для ресуспендирования осадка вируса на гранулы наносили 150 мкл буфера MNT для амплификации вируса (30 мМ MES, 100 мМ NaCl, 20 мМ Tris) или 150 мкл DMEM без фенолового красного (высокое содержание глюкозы; Sigma-Aldrich, Германия) для частиц. изоляции и хранили при 4 ° C в течение ночи.Для приготовления вирусных запасов суспензию вируса аликвотировали в криопробирки для хранения при -80 ° C. Для выделения L-частиц суспензию вируса непосредственно загружали в градиент фиколла (см. «Выделение частиц, производных от HSV-1»). Титрование вируса проводили, как описано ранее (46).

  Выделение частиц, производных HSV-1

  H- и L-частицы были выделены из супернатантов, полученных от инфицированных HSV-1 клеток BHK21, как описано в разделе «Амплификация вирусных штаммов».«Выделение H- и L-частиц было выполнено в соответствии с ранее опубликованным протоколом (47). Вкратце, градиент от 5 до 20% Ficoll PM 400 (Sigma-Aldrich, Германия) загружали суспензией вируса и центрифугировали при 26000 × g в течение 2 часов при 4 ° C. Полосы H- и L-частиц собирали пунктированием иглой, переносили в пробирки для центрифугирования (Beckman Coulter, США) и заполняли 30 мл DMEM без фенолового красного (с высоким содержанием глюкозы, Sigma-Aldrich, Германия). Оба типа частиц центрифугировали при 80 000 × g в течение 2 ч при 4 ° C.Для дальнейшего использования частицы ресуспендировали в соответствующем количестве DMEM без фенолового красного в зависимости от размера гранул и хранили при -80 ° C. Для инактивации загрязняющих Н-частиц препараты L-частиц трижды подвергали УФ-облучению с применением 0,12 Дж / см ² в Vilber Luormat (Biometra, Германия).

  Генерация дендритных клеток (DC) человека, полученных из моноцитов

  Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) были получены из камер системы лейкоредукции (LRSC) от разных здоровых доноров (48).Вкратце, раствор лимфопрепарата (Nycomed Pharma AS, Норвегия) осторожно покрывали кровью LRSC, разбавляли 1: 5 в PBS с добавлением 10% ACD-A (Lonza, Швейцария), и градиент центрифугировали при 400 × g при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого мононуклеарные клетки собирали (промежуточная фаза) и трижды промывали ледяным PBS с добавлением 1 мМ EDTA. После этого PBMC ресуспендировали в 10 мл RPMI 1640, снова центрифугировали при 300 × g в течение 5 мин и инкубировали в 25 мл среды DC [RPMI 1640 с добавлением 1% сыворотки AB человека (Sigma-Aldrich, Германия) 100 Ед / мл пенициллина и 100 Ед / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 10 мМ HEPES (все Lonza, Швейцария)] в колбах для культивирования клеток T ₁₇₅ в течение 1 ч при 37 ° C и 5% CO ₂ .Неприкрепленные клетки собирали путем трехкратной промывки колбы для культур клеток с помощью RPMI 1640 и переносили в колбу для свежих культур. Клеткам давали возможность прикрепиться второй раз в среде DC. Моноциты в первой и второй колбах для адгезии культивировали в 30 мл среды DC с добавлением 800 ед / мл GM-CSF (Miltenyi Biotec, Германия) и 250 ед / мл IL-4 (Miltenyi Biotec, Германия) для дифференциации DC. Через три дня после присоединения к каждой колбе для культивирования клеток Т ₁₇₅ добавляли 5 мл свежей среды DC, содержащей 400 ед. / Мл GM-CSF и 250 ед. / Мл IL-4.На следующий день полученные iDC были активированы путем добавления коктейля, содержащего GM-CSF (40 Ед / мл), IL-4 (250 Ед / мл), IL-1ß (Cell Genix GmbH, Германия; 200 Ед / мл), IL -6 (Cell Genix GmbH, Германия; 1000 Ед / мл), TNF-α (Peprotech, Германия; 10 нг / мл) и PGE ₂ (Pfizer, Германия; 1 мкг / мл) на каждую клетку T ₁₇₅ колба для культивирования. Через 1 точку через 5–2 дня после индукции созревания mDC использовали для последующих экспериментов.

  Процедура инфицирования мДК ВПГ-1

  Для инфекции HSV-1 определенное количество клеток mDC (2 × 10 ⁶ mDC) было ложно инфицировано или инфицировано HSV-1 в общем объеме 300 мкл инфекционной среды (RPMI 1640, 20 мМ HEPES), содержащей определенное количество запаса вируса HSV-1 для корректировки соответствующих MOI, как указано.Для УФ-облучения (HSV-1 UV) вирусный запас полностью инактивировали 8 раз, применяя 0,12 Дж / см ² в Vilber Luormat. Заражение проводили при 37 ° С и 350 об / мин в течение 1 ч. Через 1 час после инфицирования (hpi) клетки центрифугировали при 3390 × g в течение 2 минут и переносили в планшеты с лунками, содержащие среду DC (содержащую 40 Ед / мл GM-CSF и 250 Ед / мл IL-4) до конечной концентрации. из 1 × 10 ⁶ мДК / мл. Клетки инкубировали при 37 ° C и 5% CO ₂ в течение указанных промежутков времени.Для блокирования фагоцитоза с помощью цитохалазина D (CytD; Enzo Life Sciences, Германия) мДК обрабатывали 2 мкМ CytD от 1 hpi и далее.

  Эксперименты по совместному культивированию mDC и лечение антителом против HSV-1 против gB

  Для экспериментов по совместному культивированию от 1 × 10 ⁶ до 2 × 10 ⁶ mDC были ложно инфицированы или инфицированы вирусом простого герпеса-1 wt (MOI 5). Процедуру заражения выполняли, как описано в «Процедуре инфицирования ВПГ-1 мДК». При 3 hpi ложные и инфицированные HSV-1 клетки один раз промывали PBS и обрабатывали 200 мкл трипсин-EDTA (Lonza, Швейцария) с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 1 мин. Клетки промывали RPMI и PBS и переносили в планшеты с лунками, содержащие среду DC с добавлением 40 ед. / Мл GM-CSF и 250 ед. / Мл IL-4. Впоследствии при 6 hpi инфицированные HSV-1 клетки сокультивировали в 96-луночном планшете с круглым дном с ложно обработанными (каждое от 0,125 × 10 ⁶ до 0,15 × 10 ⁶ ) клетками.

  Нейтрализующее анти-gB-специфическое антитело HSV-1 [hu2c (49, 50)] и контрольное антитело против CD28 (BD Pharmingen, очищенное NA / LE мышиное анти-человеческое CD28) наносили в конечной концентрации 75 мкг / мл.Эта концентрация основана на эффективности hu2c анти-gB для нейтрализации вирионов HSV-1 с использованием высоких значений MOI 50 (данные не показаны). Клетки собирали через 24 часа на дюйм и анализировали в отношении их поверхностной экспрессии IL6R с помощью проточной цитометрии, как описано в разделе «Проточные цитометрические анализы и сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS)».

  Обработка мДК частицами, производными от HSV-1

  зрелых DC инкубировали с частицами, производными от HSV-1, следующим образом: 1 × 10 ⁶ клеток были ложно инфицированы или инфицированы HSV-1 (MOI 2), инкубированы с очищенными H-частицами (MOI 2) или L -частицы (вирусный материал, соответствующий высоким MOI). Для инактивации маргинальных загрязнений H-частицами L-частицы были инактивированы трехкратным применением 0,12 Дж / см ² в Vilber Luormat. Заражение проводили, как описано выше. При 1 hpi mDC переносили без центрифугирования в среду DC, содержащую 40 ед. / Мл GM-CSF и 250 ед. / Мл IL-4. Клетки собирали через 24 часа на дюйм и готовили для анализа проточной цитометрией.

  Проточный цитометрический анализ и сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS)

  Клетки собирали в указанные моменты времени после инфицирования путем ресуспендирования клеток в соответствующем 6-, 12- или 24-луночном планшете.Клетки переносили в пробирки на 1,5 мл и один раз промывали буфером для окрашивания (PBS, содержащий 2% FCS). Окрашивание поверхности IL6R выполняли в буфере для окрашивания, содержащем IL6R-специфическое антитело (Biolegend, PE-Cy7, клон UV4) и окрашивание LIVE / DEAD Fixable Violet мертвых клеток (Life Technologies, Калифорния, США) для различения живых и мертвых клеток. при 4 ° C в течение 60 мин в темноте. После этого клетки дважды промывали буфером для окрашивания и фиксировали 2% PFA в буфере для окрашивания. Внутриклеточный IL6R окрашивали в соответствии с инструкциями по изготовлению использованного набора BD Cytofix / Cytoperm ™ (BD Biosciences, Германия).В качестве контроля параллельно анализировали неокрашенные клетки. Экспрессию IL6R оценивали с помощью проточного цитометра FACS Canto II (BD Biosciences, Германия). Данные анализировали с помощью программного обеспечения FCS express 5 flow research edition ( De Novo Software). GFP-положительную и GFP-отрицательную популяцию анализировали с использованием различных наборов ворот в программном обеспечении для оценки данных.

  Для сортировки клеток на основе сигнала GFP клетки собирали 16 hpi и один раз промывали PBS, содержащим 4% FCS.После этого клетки инкубировали с ДНКазой в течение 30 мин при 37 ° C и затем хранили на льду. Клетки разделяли на GFP-положительные и GFP-отрицательные фракции с использованием сортировщика клеток BD Aria FACS (BD Biosciences, Германия).

  Получение лизатов белков и иммуноблоттинг

  Для приготовления белковых лизатов отсортированных клеток осадок один раз промывали ледяным PBS и затем ресуспендировали в 35 мкл натрий-дезоксихолатного буфера для лизиса (10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 137 мМ NaCl, 50 мМ Трис, pH 8.0, 0,5% NP-40) со свежими добавками 2 мМ фенилметилсульфонилфторида, 2 мМ ортованадата натрия, 20 мМ фторида натрия, 0,1 М MgCl ₂ и бензоназы и лизировали на льду в течение 20 мин. После центрифугирования при 13 500 × g при 4 ° C в течение 20 минут супернатанты собирали и определяли концентрацию белка в каждом лизате с использованием определения белка Брэдфорда. Затем лизаты белков смешивали с 4x Roti-load 1 (конечная концентрация: 1x; Carl Roth GmbH, Германия) с последующей денатурацией белков при 95 ° C в течение 10 мин.Для приготовления белковых лизатов изолированных H- и L-частиц растворы частиц смешивали с 4x Roti-Load 1 (конечная концентрация: 1x) и денатурировали при 95 ° C в течение 10 минут сразу после выделения.

  Белковые лизаты, полученные из клеточного или вирусного материала, загружали в 10% полиакриламидные гели SDS и разделяли с помощью SDS-PAGE. После этого белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом влажного блоттинга. После блокирования мембраны в 1x Roti-block (Carl Roth GmbH, Германия) в течение 1 ч при комнатной температуре мембрану инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C.Антитела детектировали с помощью Image Quant и ECL с использованием реагента для определения вестерн-блоттинга Amersham ECL Prime (GE Healthcare, Германия) после инкубации мембраны с вторичным антителом, конъюгированным с HRP. Все антитела разводят в 1x Roti-блоке и используют следующим образом: антитело ICP5 (Санта-крус, sc-56989, клон 3B6, 1: 1000), антитело gB (Санта-крус, sc-56987, клон 10B7, 1: 1000), Антитело ICP4 (Santa cruz, sc-56986, клон 10F1, 1: 1000), антитело ICP0 (Santa cruz, sc-53070, клон 11060, 1: 1000), антитело GAPDH (EMD Millipore Corp., клон MAB374, 1: 5000), антитело против GFP (Santa cruz, sc-9996, клон B-2, 1: 1000), поликлональное антитело против мышиного IgG, связанное с HRP (передача сигналов клеток, 1: 2500).

  Выделение РНК, синтез кДНК и количественный анализ ПЦР в реальном времени (qPCR)

  Для выделения РНК клетки собирали и один раз промывали ледяным PBS. Тотальную РНК выделяли с помощью набора QIAshredder (Qiagen, Германия) и набора RNeasy Plus Mini (Qiagen, Германия) согласно инструкциям производителя. Впоследствии кДНК была транскрибирована (0.5 мкг РНК в общем объеме 20 мкл) с использованием праймеров Oligo-dT и набора для синтеза первой цепи кДНК Revert Aid (Invitrogen Thermo Fisher Scientific, Германия). Для анализов кПЦР была приготовлена ​​следующая смесь: 5 мкл кДНК (концентрация 2,5 нг / мкл), 0,8 мкл смыслового праймера (10 мкМ), 0,8 мкл антисмыслового праймера (10 мкМ), 3,4 мкл H ₂ O и 10 мкл смеси S’Green qPCR 2x Mix (Biozym, Германия).

  Для кПЦР использовали следующие праймеры: смысл IL6R (5′-TTG TTT GTG AGT GGG GTC CT-3 ‘), антисмысловой IL6R (5′-TGG GAC TCC TGG GAA TAC TG-3′), контрольные транскрипты S14 смыслового ( 5’-GGC AGA CCG AGA TGA ATC CTC A-3 ‘), антисмысловой S14 (5′-CAG GTC CAG GGG TCT TGG TCC-3’). Все праймеры были проверены в соответствии с рекомендациями Минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени (MIQE). Сначала образцы нагревали до 95 ° C в течение 3 мин. Следующие 45 циклов были выполнены следующим образом: 15 с при 95 ° C, 15 с при 61 ° C и 15 с при 72 ° C. После этого был выполнен анализ кривой плавления, подвергая образцы изменению температуры (от 65 до 95 ° C со скоростью 0,1 ° C / с). Количественную ПЦР в реальном времени проводили в системе реального времени Touch Thermal Cycler CFX96 (Bio-Rad, Германия).Окончательный анализ проводили с помощью программного обеспечения CFX Manager 3.0 (Bio Rad, Германия), и результаты были нормализованы по экспрессии эталонного гена S14 (dCq) и ложного контроля (ddCq).

  Допуски и юридические требования

  Разрешение на проведение экспериментов с человеческими ДК, полученными из моноцитов, полученных из продуктов лейкафереза ​​здоровых доноров, было получено от местного этического комитета (номер ссылки: 184_16Bc). Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями этического комитета «Университета Фридриха Александра в Эрлангене-Нюрнберге» с письменного информированного согласия всех субъектов.Все субъекты дали письменное информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией.

  Статистический анализ

  Проточные цитометрические анализы отображаются как медиана ± стандартное отклонение (SD), как указано. Для определения значимости данные анализировали с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и теста Бонферрони с множественным сравнением post hoc или непарного теста t с односторонним анализом, как указано. Значимость была принята для p <0.05. **** п ≤ 0,0001; *** p ≤ 0,001; ** p ≤ 0,01; * p ≤ 0,05; и нс, не имеет значения.

  Результаты

  Уровни экспрессии белка и мРНК IL6R модулируются в мДК, инфицированных HSV-1, и мДК-свидетелей

  Предыдущие исследования показали, что HSV-1 специфически модулирует различные белки, экспрессируемые mDC, например, CD83, CCR7, CXCR4 и CYTIP, для захвата важных функций mDC (18, 21, 22). Поскольку передача сигналов IL-6 в мДК является критическим путем во время иммунного ответа, мы исследовали, модулирует ли и как ВПГ-1 экспрессию IL6R с помощью мДК.Таким образом, в первом подходе mDC были инфицированы HSV-1 с использованием экспрессирующего EGFP репортерного штамма HSV-1 (обозначенного здесь как HSV-1 wt) с низким MOI 0,65, чтобы впоследствии различать инфицированные HSV-1 GFP-положительные клетки и неинфицированные GFP-отрицательные mDC. Используя программное обеспечение для оценки данных, мы можем специально выделить GFP-отрицательную и GFP-положительную фракции и индивидуально исследовать обе популяции. Мок-инфицированные mDC служили контролем. Непосредственно инфицированные и неинфицированные посторонние mDC контролировали в отношении их поверхностной экспрессии рецептора IL-6 (IL6R) во время кинетики инфекции HSV-1 с помощью проточной цитометрии.Уже на 6–8 hpi явно сниженные уровни поверхностной экспрессии IL6R были обнаружены на GFP-положительных мДК, инфицированных HSV-1, по сравнению с ложными клетками (рис. 1A, зеленая линия). Этот эффект резко усилился в течение времени после инфицирования, что привело к почти полной потере экспрессии IL6R на поверхности клеток мДК, непосредственно инфицированных HSV-1, через 24 часа на дюйм по сравнению с фиктивным контролем. Удивительно, что сниженные уровни поверхностной экспрессии IL6R по сравнению с ложно инфицированными mDC наблюдались не только на напрямую инфицированных, но также и на неинфицированных GFP-отрицательных сторонних mDC.Примечательно, что на неинфицированных посторонних mDC этот эффект проявлялся своевременно и с задержкой, а также был менее выражен по сравнению с напрямую инфицированными GFP-положительными mDC (рис. 1A, синяя линия). Поскольку было описано, что IL6R преимущественно присутствует во внутриклеточных компартментах, например, в рециркулирующих эндосомах, нас интересовало, влияет ли HSV-1 на уровни внутриклеточной экспрессии IL6R (29). Используя ту же экспериментальную установку, что описана выше, проточный цитометрический анализ выявил снижение уровней внутриклеточного IL6R в прямо GFP-положительных и неинфицированных сторонних mDC по сравнению с ложно инфицированными mDC (рис. 1B).В отличие от анализа поверхностной экспрессии IL6R, уровни внутриклеточной экспрессии одинаково регулировались в GFP-положительных и GFP-отрицательных mDC (рис. 1B, внутриклеточный).

  Рисунок 1 . Модуляция HSV-1 экспрессии IL6R в / на GFP-положительных, напрямую инфицированных, и GFP-отрицательных, посторонних мДК. (A) Зрелые DC были ложно инфицированы или инфицированы вирусом простого герпеса-1 (MOI 0,65) и собирались в указанные моменты времени после инфицирования (0–24 hpi). Поверхностную экспрессию IL6R анализировали на ложных (100%, черная линия), GFP-положительных (зеленая линия) и GFP-отрицательных (синяя линия) мДК с помощью проточной цитометрии.Эксперимент проводили не менее четырех раз с клетками, полученными от разных здоровых доноров. Зеленые звездочки указывают на статистический анализ GFP-положительных и ложно обработанных клеток, синие звездочки — на статистический анализ GFP-отрицательных и ложно обработанных клеток, а черные звездочки — на статистику GFP-отрицательных и GFP-положительных клеток. (B) Зрелые DC были ложно инфицированы или инфицированы вирусом простого герпеса-1 wt (MOI 0,6) и собирались при 24 hpi. Клетки окрашивали с использованием антитела, специфичного к IL6R, для оценки уровней внеклеточной и внутриклеточной экспрессии.Поверхностную экспрессию IL6R анализировали на ложных (100%, черная линия), GFP-положительных (зеленая линия) и GFP-отрицательных (синяя линия) мДК с помощью проточной цитометрии. Статистический анализ уровней внутриклеточной экспрессии IL6R между GFP-положительными и GFP-отрицательными образцами проводился с применением непарного теста t . (A, B) Различие между инфицированными и неинфицированными mDC основано на сигнале GFP и используемых воротах в программном обеспечении для оценки данных FCS Express 5, которые специфичны для GFP-положительной или GFP-отрицательной популяции. (C) Зрелые DC были имитированы или инфицированы вирусом простого герпеса-1 wt (MOI 2, несортированные клетки) и собирались в указанные моменты времени после инфицирования (2–24 hpi). Выделяли РНК и проводили кПЦР. Относительные уровни экспрессии мРНК IL6R нормализованы к S14 и показаны относительно соответствующего ложного состояния. Эксперимент проводили четыре раза с клетками, выделенными от разных здоровых доноров. (D) Зрелые DC были ложно инфицированы или инфицированы вирусом простого герпеса-1 wt (MOI 0,6) и собраны с 16 hpi. Впоследствии клетки сортировали на основе их экспрессии GFP на GFP-положительные и GFP-отрицательные mDC.РНК выделяли, транскрибировали в кДНК и использовали для последующих экспериментов кПЦР. Относительные уровни экспрессии мРНК IL6R нормализованы до S14. Уровни транскрипта IL6R показаны относительно соответствующего ложного состояния. Эксперимент проводили трижды с клетками, полученными от разных здоровых доноров. Планки ошибок указывают SD. Существенные изменения в имитации были проанализированы с использованием одностороннего дисперсионного анализа и множественного сравнения Бонферрони апостериорных тестов и обозначены звездочками (* p ≤ 0. 05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). Незначительные изменения ( p > 0,05) обозначены как «нс».

  Для дальнейшего выяснения того, присутствует ли HSV-1-опосредованная модуляция поверхностной экспрессии IL6R также на уровнях мРНК, были выполнены анализы qPCR с использованием кДНК, полученной из мДК, инфицированных ложным вирусом или HSV-1 wt (2-24 hpi). В соответствии с модуляцией белка IL6R на поверхности клетки, также значительно снизилось количество специфичных для IL6R транскриптов в мДК, инфицированных HSV-1 (рис. 1C).В отличие от модуляции уровня белка IL6R, уже на уровне 2 hpi мРНК IL6R снижается до ~ 50% по сравнению с ложно обработанными клетками.

  Кроме того, уровни экспрессии мРНК IL6R анализировали отдельно в непосредственно инфицированных GFP-положительных и GFP-отрицательных сторонних мДК при 16 hpi. Для этого mDC инфицировали HSV-1 wt (MOI 0,6) с последующей FACS на основе сигнала GFP в качестве индикатора прямого заражения. Как показано на рис. 1D, уровни транскрипции IL6R были снижены не только в GFP-положительных, но также и в GFP-отрицательных сторонних мДК, однако в меньшей степени.Взятые вместе, эти данные показали, что поверхностная экспрессия IL6R, а также экспрессия мРНК значительно затрудняются во время инфекции HSV-1, как в непосредственно инфицированных, так и в неинфицированных посторонних мДК.

  Модуляция поверхностной экспрессии IL6R передается от непосредственно инфицированных HSV-1 неинфицированным посторонним мДК

  Для получения дополнительных сведений о сниженных уровнях поверхностной экспрессии IL6R на клетках-свидетелях по сравнению с ложно инфицированными mDC были проведены эксперименты с сокультивированием.MDC, инфицированные HSV-1, собирали через 6 hpi, инкубировали с трипсином для удаления поверхностно связанных вирионов, а затем совместно культивировали с неинфицированными mDC. Через 24 часа на дюйм клетки анализировали с использованием антитела, специфичного к IL6R, и исследовали с помощью проточной цитометрии. На фигуре 2A показано, что HSV-1 модулирует поверхностную экспрессию IL6R не только на непосредственно инфицированных GFP-положительных mDC, но также и на неинфицированных GFP-отрицательных сторонних mDC по сравнению с фиктивным контролем. Основываясь на этих результатах, мы пришли к выводу, что поверхностная экспрессия IL6R также затруднялась на совместно культивированных мДК, которые не подвергались непосредственному воздействию инфекционного вируса до совместного культивирования.Кроме того, мы исследовали влияние трипсина на поверхностную экспрессию IL6R и не обнаружили влияния на его экспрессию (данные не показаны). Затем мы проанализировали, могут ли вирусные белки переноситься из мДК, инфицированных ВПГ-1, в посторонние мДК. Следовательно, mDC были инфицированы HSV-1 wt (MOI 0,6) и рассортированы по экспрессии GFP на GFP-положительные и GFP-отрицательные фракции 16 hpi. Вестерн-блоттинг этих отсортированных клеток показал, что, за исключением капсид-ассоциированного инфицированного клеточного белка (ICP) 5, вирусные белки, такие как ICP0 и ICP4, были перенесены в сторонние mDC (рис. 2B).Взятые вместе, эти результаты показывают, что вирусные компоненты передаются непосредственно от мДК, инфицированных ВПГ-1, на неинфицированные посторонние мДК, запуская модуляцию IL6R.

  Рисунок 2 . Опосредованная HSV-1 модуляция IL6R передается от напрямую инфицированных GFP-положительных к неинфицированным GFP-отрицательным сторонним mDC. (A) Зрелые DC были ложно инфицированы или инфицированы вирусом простого герпеса-1 wt (MOI 5), все образцы были обработаны трипсином при 3 hpi и впоследствии совместно культивированы с неинфицированными mDC при 6 hpi.MDC, инфицированные вирусом простого герпеса-1 wt, были включены в качестве положительного контроля («HSV-1», серая полоса). Клетки собирали через 24 часа на дюйм, окрашивали IL6R-специфическим антителом и анализировали с помощью цитометрии. Различие между инфицированными и неинфицированными mDC основано на сигнале GFP и используемых воротах в программном обеспечении для оценки данных FCS Express 5, которые специфичны либо для GFP-положительной, либо для GFP-отрицательной популяции. Поверхностная экспрессия IL6R показана как медиана и нормализована к ложному состоянию. Эксперимент проводили пять раз с клетками, полученными от разных здоровых доноров.Планки ошибок указывают SD. Существенные изменения были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Бонферрони post hoc тестов и отмечены звездочками (*** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). (B) Зрелые DC были ложно инфицированы или инфицированы вирусом простого герпеса-1 wt (MOI 0,6) и собраны с 16 hpi. Впоследствии клетки были отсортированы на основе их экспрессии GFP на GFP-положительные и GFP-отрицательные фракции mDC. Лизаты белков отсортированных клеток анализировали с помощью вестерн-блоттинга для обнаружения ICP0, ICP4, ICP5, GFP и GAPDH в качестве контроля загрузки.Эксперимент проводили трижды с клетками, полученными от разных здоровых доноров.

  В следующем эксперименте мы стремились проанализировать, играет ли фагоцитоз роль во время наблюдаемой HSV-1-опосредованной модуляции IL6R на неинфицированных сторонних мДК. Апоптоз мДК, инфицированных ВПГ-1, может привести к их поглощению посторонними мДК. Это могло вызвать снижение поверхностной экспрессии IL6R на этих неинфицированных посторонних мДК по сравнению с ложно инфицированными мДК. Чтобы подтвердить или опровергнуть эту гипотезу, мДК были ложно инфицированы или инфицированы вирусом простого герпеса-1 wt, обработаны ингибитором фагоцитоза цитохалазином D (CytD) или ДМСО в качестве контроля и собраны 16 hpi.В дальнейшем было подтверждено успешное ингибирование фагоцитоза CytD (данные не показаны). Как показано на фиг. 3, HSV-1 индуцировал значительную модуляцию поверхностной экспрессии IL6R на непосредственно инфицированных, а также на неинфицированных посторонних мДК, также в присутствии ингибитора фагоцитоза CytD. Таким образом, наши результаты демонстрируют, что HSV-1 индуцирует независимую от фагоцитоза модуляцию экспрессии IL6R на сторонних мДК.

  Рисунок 3 . Модуляция поверхностной экспрессии IL6R на сторонних мДК не зависит от фагоцитоза. Зрелые DC были ложно инфицированы или инфицированы вирусом простого герпеса-1 wt (MOI 0,65), обрабатывались цитохалазином D (CytD) или без него с 1 hpi в процессе и собирались с 16 hpi. Клетки окрашивали антителом, специфичным к IL6R, для последующего анализа проточной цитометрией. Различие между инфицированными и неинфицированными mDC основано на сигнале GFP и используемых воротах в программном обеспечении для оценки данных FCS Express 5, которые специфичны либо для GFP-положительной, либо для GFP-отрицательной популяции. Медиана поверхностной экспрессии IL6R была нормализована для имитации уровней экспрессии.Эксперимент проводили шесть раз с клетками, полученными от разных здоровых доноров. Планки ошибок указывают SD. Существенные изменения были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Бонферрони post hoc тестов и отмечены звездочками (** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). Незначительные изменения ( p > 0,05) обозначены как «нс».

  HSV-1 модулирует уровни экспрессии IL6R также посредством механизма, независимого от репликации

  Мы описали до сих пор, что репликационно-компетентные вирионы HSV-1 индуцируют модуляцию IL6R на / в мДК (Рисунок 1).Чтобы оценить, может ли это происходить независимо от репликации, мДК инокулировали УФ-инактивированными вирионами HSV-1 wt (8 × 0,12 Дж / см ² ) с использованием увеличения MOI в диапазоне от 2 до 200. Дано Тот факт, что облученные УФ-излучением вирионы HSV-1 неспособны к репликации, отсутствует синтез вирусного белка de novo и только вирусные белки, уже присутствующие в тегументе во время инокуляции мДК, способны модулировать экспрессию клеточных белков.В качестве контролей мДК обрабатывали или инфицировали интактными вирионами дикого вируса HSV-1 (MOI 2), а для проточного цитометрического анализа клетки собирали через 24 часа на дюйм (фиг. 4A). При использовании умеренных MOI (например, вирусного материала, соответствующего MOI 2), инокуляция мДК УФ-инактивированным ВПГ-1 лишь незначительно влияла на поверхностную экспрессию IL6R по сравнению с ложно инфицированными мДК. Однако более высокие количества УФ-инактивированного HSV-1 (вирусный материал, соответствующий MOI 20 или 200) значительно нарушали поверхностную экспрессию IL6R.В частности, инокуляция мДК вирусным материалом, инактивированным ультрафиолетом, соответствующим MOI 200, вызвала ~ 50% снижение поверхностной экспрессии IL6R по сравнению с контрольными образцами, обработанными имитацией.

  Рисунок 4 . HSV-1 индуцирует модуляцию IL6R через независимый от репликации механизм. (A, B) Зрелые ДК были имитированы (черные столбцы) или инфицированы вирусом простого герпеса-1 wt (MOI 2, серые столбцы) или инкубированы с УФ-инактивированными вирионами HSV-1 с использованием указанных MOI (вирусный материал, соответствующий до MOI 2, 20, 200, облучение 8 раз с применением 0.12 Дж / см ² , черные штриховые полосы). (A) Клетки собирали через 24 часа на дюйм, окрашивали IL6R-специфическим антителом и поверхностную экспрессию анализировали с помощью проточной цитометрии. Медиана поверхностной экспрессии IL6R была нормализована к уровням экспрессии ложно обработанных клеток. Эксперимент проводили трижды с клетками, полученными от разных здоровых доноров. (B) Клетки собирали через 2, 4, 6 hpi. Выделяли РНК и проводили кПЦР с использованием транскрибированной кДНК. Относительные уровни экспрессии мРНК IL6R нормализованы к S14 и показаны относительно соответствующего ложного состояния.Эксперимент проводился от трех до семи раз с клетками, полученными от разных здоровых доноров. Планки ошибок указывают SD. Существенные изменения в имитации были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Бонферрони post hoc тестов и обозначены звездочками (* p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). Незначительные изменения ( p > 0,05) обозначены как «нс».

  Кроме того, мы выполнили анализ экспрессии мРНК IL6R в ранние моменты времени после заражения. Как показано на фиг. 4B, также в mDC, обработанных УФ-облученными вирионами HSV-1 wt (вирусный материал, соответствующий MOI 2), значительно более низкие уровни мРНК IL6R были обнаружены при 4–6 hpi. Этот эффект усиливается при использовании большего количества вирионов, облученных УФ-излучением. Таким образом, мы пришли к выводу, что в мДК HSV-1 регулирует уровни экспрессии IL6R также посредством независимого от репликации механизма, который может запускаться по крайней мере одним кодируемым вирусом белком, который включен в вирионы HSV-1.

  L-частицы, производные HSV-1, достаточны для модуляции поверхностной экспрессии IL6R на мДК сторонних наблюдателей

  Продемонстрировав, что регуляция IL6R происходит не только на напрямую инфицированных GFP-положительных, но также и на GFP-отрицательных сторонних mDC в экспериментах по совместному культивированию, мы предположили, что растворимый фактор, передаваемый от HSV-1-инфицированных к неинфицированным сторонним mDC, может быть ответственным за Модуляция IL6R на сторонних mDC. Недавно сообщалось, что производство инфекционных H-частиц затруднено в мДК, инфицированных HSV-1, в результате чего преимущественно высвобождаются неинфекционные L-частицы (13). Кроме того, описано, что L-частиц достаточно для снижения уровня белка CD83 в клетках-свидетелях (16). Таким образом, было заманчиво предположить, что L-частицы также могут играть важную роль в опосредованной HSV-1 регуляции IL6R на mDC. Чтобы проверить это, неинфекционные L-частицы и зрелые вирионы (H-частицы) отдельно выделяли из инфицированных вирусом простого герпеса-1 wt-инфицированных клеток BHK21.Впоследствии оба препарата частиц были охарактеризованы в отношении присутствия или отсутствия специфических вирусных белков, таких как ICP5, главный белок капсида, присутствующий в инфекционных H-частицах и, как ожидалось, отсутствующий в L-частицах (рис. 5A). Дополнительные вирусные белки, такие как ICP0, ICP4 и гликопротеин B (gB), присутствуют в обоих типах частиц.

  Рисунок 5 . HSV-1-опосредованная модуляция IL6R передается через L-частицы от непосредственно инфицированных GFP-положительных к неинфицированным GFP-отрицательным сторонним mDC. (A) Вестерн-блоттинг очищенных L- и H-частиц, полученных из клеток BHK21. Использовали антитела, специфичные к ICP0, ICP4, ICP5 и gB. Показан один примерный эксперимент из десяти. (B) Зрелые DC были инфицированы HSV-1 wt (MOI 0,65), очищенными H-частицами (MOI 0,65) или обработаны L-частицами (вирусный материал, соответствующий высокой MOI, облученный три раза с применением 0,12 Дж. / см ² , белая полоса). Клетки собирали через 24 часа на дюйм и анализировали на предмет их поверхностной экспрессии IL6R с помощью проточной цитометрии.Эксперимент проводили трижды с клетками, полученными от разных здоровых доноров. (C) Зрелые DC были ложно инфицированы или инфицированы вирусом простого герпеса-1 wt (MOI 5), и все образцы были обработаны трипсином при 3 hpi. Впоследствии инфицированные клетки совместно культивировали с неинфицированными mDC в присутствии антитела, специфичного к gB, контрольного антитела против CD28 или PBS (ctrl) при 6 hpi. MDC, инфицированные вирусом простого герпеса-1, культивированные в течение 24 часов, были включены в качестве положительного контроля («HSV-1», серая полоса). Клетки собирали через 24 часа на дюйм и окрашивали антителом, специфичным к IL6R, и анализировали проточной цитометрией.GFP-положительные напрямую инфицированные mDC (зеленые столбцы) и GFP-отрицательные неинфицированные сторонние mDC (синие столбцы) в сокультуре изображены для каждого состояния. Эксперимент проводился от трех до шести раз с клетками от разных доноров. (B, C) Различие между инфицированными и неинфицированными mDC основано на сигнале GFP и используемых воротах в программном обеспечении для оценки данных FCS Express 5, которые специфичны либо для GFP-положительной, либо для GFP-отрицательной популяции. Планки погрешностей указывают на SD. Существенные изменения в имитации были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Бонферрони post hoc тестов и обозначены звездочками (**** p ≤ 0. 0001).

  Что касается наблюдаемой поверхностной регуляции IL6R на GFP-отрицательных мДК сторонних наблюдателей и на основании нашего анализа кинетики времени, нельзя исключить участие L-частиц, которые присутствуют в исходных препаратах HSV-1 (рис. . Поскольку L-частицы лишены вирусного капсида и, следовательно, генома, различие между mDC, на которые воздействует L-частица данного вирусного сырья, и GFP-отрицательные сторонние mDC невозможно. Однако для оценки участия L-частиц, содержащихся в исходном вирусе, mDC были либо инфицированы вирусом простого герпеса-1 wt, либо подвергались воздействию очищенных H-частиц (MOI 2) в течение 24 часов (рис. 5B).Результаты этого эксперимента, изображенные на Фигуре 5B, показали, что на поверхностную экспрессию IL6R на GFP-отрицательных сторонних mDC в равной степени влияла инфекция очищенными H-частицами, как и с использованным исходным вирусом HSV-1, содержащим как H-, так и L. -частицы (синяя полоса «H-частицы»). Таким образом, мы пришли к выводу, что L-частицы, содержащиеся в исходном материале вируса, явно не влияют на поверхностную экспрессию IL6R на неинфицированных GFP-отрицательных mDC. Наконец, чтобы доказать, что L-частицы способны снижать поверхностную экспрессию IL6R на неинфицированных сторонних mDC, mDC инокулировали очищенными L-частицами, и поверхностную экспрессию IL6R анализировали, как показано на Фигуре 5B (белая полоса).Важно отметить, что обработка мДК очищенными L-частицами была способна и достаточна для значительного снижения экспрессии IL6R на мДК по сравнению с ложно инфицированными мДК.

  Показав, что L-частицы действительно участвуют в регуляции IL6R, мы исследовали, может ли нейтрализующее анти-gB специфическое антитело вмешиваться в этот опосредованный L-частицами эффект на неинфицированных посторонних мДК. Кодируемая ВПГ-1 поверхностная молекула gB необходима для прикрепления ВПГ-1 к клетке-хозяину посредством связывания с гепарансульфат-протеогликанами (HSPG) и парным Ig-подобным рецептором альфа типа 2 (PILRα) (7, 51).И HSPG, и PILRα экспрессируются на DC (52, 53). Таким образом, гуманизированное моноклональное антитело против gB, ранее идентифицированное как мощный ингибитор свободных вирионов HSV-1 и распространения HSV-1 от клетки к клетке, было применено в эксперименте по совместному культивированию (49). Наша гипотеза заключалась в том, что это антитело блокирует перенос и поглощение L-частиц от непосредственно инфицированных к неинфицированным посторонним мДК и тем самым ингибирует опосредованную L-частицами модуляцию IL6R на посторонних мДК. Интересно, что сниженные уровни поверхностной экспрессии IL6R на клеточной поверхности GFP-отрицательных сторонних mDC были значительно восстановлены этим анти-gB антителом по сравнению с mDC, обработанными ложно (фигура 5C, синяя полоса, + анти-gB).Антитело против CD28 или PBS (ctrl) использовали в качестве отрицательного контроля и не восстанавливали поверхностную экспрессию IL6R на GFP-отрицательных сторонних mDC (фигура 5C, синие столбцы + PBS и + анти-CD28). Аналогичным образом, экспрессия IL6R на мДК, непосредственно инфицированных HSV-1, не зависела от антитела против gB или контролей (рис. 5C, зеленые и серые столбцы). Таким образом, эти результаты ясно подтверждают вывод о том, что L-частицы, генерируемые mDC во время инфекции HSV-1, передают вирусные белки неинфицированным сторонним mDC, тем самым модулируя поверхностную экспрессию IL6R.

  Белок Vhs, кодируемый HSV-1, участвует в снижении уровня IL6R в напрямую инфицированных и неинфицированных мДК свидетелей

  Для выяснения того, какой вирусный белок способствует регуляции IL6R во время инфекции HSV-1, были протестированы различные штаммы HSV-1, в которых отсутствуют специфические вирусные белки, на предмет их влияния на модуляцию IL6R во время инфекции mDC. Поскольку все протестированные штаммы с делецией HSV-1 (ΔICP0, ΔICP27, ΔICP34.5 / ΔICP47), за исключением HSV-1 Δvhs, влияли на поверхностную экспрессию IL6R на напрямую инфицированных mDC, сравнимых с HSV-1 wt (данные не показаны), мы сосредоточились на исходный запас вируса HSV-1 удаляли для экспрессии белка отключения вириона-хозяина (vhs).Ген vhs кодирует вирусную эндорибонуклеазу, которая важна для деградации как клеточных, так и вирусных мРНК (44, 45). Что касается вовлечения vhs, mDC были ложно инфицированы или инфицированы Δvhs HSV-1 (MOI 0,6) и собирались в разные моменты времени 2–24 hpi. Δvhs-инфицированные mDC HSV-1 также экспрессируют EGFP, что позволяет различать GFP-положительные инфицированные и GFP-отрицательные сторонние mDC при использовании низкого MOI 0,6. На GFP-положительных мДК HSV-1, инфицированных Δvhs, поверхностная экспрессия IL6R была сильно нарушена, становясь значимой при 8 hpi (рис. 6A, зеленая линия).Для сравнения, в mDC, инфицированных вирусом простого герпеса HSV-1, этот эффект уже наблюдался при 4 hpi (см. Рис. 1A, зеленая линия). Тем не менее, в более поздние моменты времени (16–24 hpi) поверхностная экспрессия IL6R на мДК, инфицированных HSV-1 Δvhs, снижалась до уровней, сравнимых с HSV-1 wt. Напротив, уровни экспрессии IL6R на неинфицированных GFP-отрицательных сторонних мДК заметно различались между инфекциями HSV-1 wt и HSV-1 Δvhs (Фигуры 1A, 6A; синие линии). В то время как GFP-отрицательные сторонние mDC демонстрировали на 60–70% более низкую экспрессию IL6R на поверхности при инфицировании wt 16–24 hpi, Δvhs-инфицированные mDC экспрессировали примерно на 25% сниженные уровни IL6R по сравнению с соответствующим ложным контролем.

  Рисунок 6 . Вирусный белок vhs HSV-1 частично участвует в регуляции IL6R в инфицированных mDC, а также в неинфицированных сторонних mDC. (A) Зрелые DC были ложно инфицированы или инфицированы HSV-1 Δvhs (MOI 0,6) и собирались в указанные моменты времени после инфицирования. Поверхностную экспрессию IL6R анализировали на ложных (100%, черная линия), GFP-положительных (зеленая линия) и GFP-отрицательных (синяя линия) мДК HSV-1, инфицированных Δvhs, с помощью проточной цитометрии. Различие между инфицированными и неинфицированными mDC основано на сигнале GFP и используемых воротах в программном обеспечении для оценки данных FCS Express 5, которые специфичны либо для GFP-положительной, либо для GFP-отрицательной популяции.Этот эксперимент был проведен трижды с клетками, полученными от разных здоровых доноров. Зеленые звездочки обозначают статистический анализ mDC-GFP-положительных и ложно обработанных, синие звездочки — статистические анализы GFP-отрицательных и ложно-обработанных mDC, а черные звездочки — статистику GFP-отрицательных и GFP-положительных состояний. (B) Зрелые DC обрабатывали ложно (черная полоса) или Δvhs-инфицированными HSV-1 (MOI 2, оранжевые полоски) и собирали в указанные моменты времени после инфицирования (2–24 hpi).Выделяли РНК и проводили кПЦР с использованием транскрибированной кДНК. Относительные уровни экспрессии мРНК IL6R нормализованы к S14 и показаны относительно соответствующего ложного состояния. Этот эксперимент проводился от трех до семи раз с клетками, полученными от разных здоровых доноров. (C) Зрелые DC были ложно инфицированы или инфицированы Δvhs HSV-1 (MOI 0,6) и собраны с 16 hpi. Впоследствии клетки сортировали на основе их экспрессии GFP на фракции GFP-положительных и GFP-отрицательных mDC. РНК выделяли и транскрибировали кДНК, которую использовали для последующих экспериментов кПЦР.Относительная экспрессия мРНК IL6R нормализована до S14, и уровни транскриптов показаны относительно соответствующего ложного состояния. Точки данных основаны на анализе клеток от четырех разных здоровых доноров. Планки ошибок указывают SD. Существенные изменения были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Бонферрони post hoc тестов и обозначены звездочками (* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, * *** p ≤ 0,0001). Незначительные изменения ( p > 0.05) обозначаются буквой «нс».

  Модуляция экспрессии IL6R также анализировалась на уровне мРНК. Как изображено на Фигуре 6B, IL6R был нарушен по зависящему от времени механизму в mDC, инфицированных HSV-1 Δvhs, становясь статистически значимыми при 4 hpi. Напротив, мДК, инфицированные вирусом простого герпеса-1 wt, уже демонстрировали серьезное снижение уровней мРНК IL6R через 2 часа заражения (рис. 1В). Кроме того, уровни транскрипта IL6R были также проанализированы в отсортированных GFP-положительных инфицированных и GFP-отрицательных случайных мДК (фиг. 6C).Эти данные ясно демонстрируют, что vhs влияет на уровни мРНК IL6R в сторонних мДК. В заключение, наши наблюдения показывают, что вирусный белок тегумента vhs играет важную роль в регуляции IL6R в / на непосредственно инфицированных mDC (ранние временные точки) и даже более важную роль в регуляции в / на неинфицированных сторонних mDC.

  Обсуждение

  HSV-1 представляет собой очень успешный патогенный вирус человека, хорошо приспособленный для выживания и модуляции своих клеток-хозяев.Что касается этого, HSV-1 приобрел несколько механизмов иммунного уклонения в разных типах клеток, например, нарушение презентации MHC класса I и II (54-56), подавление CD83 на mDC (16, 18) или ингибирование миграции mDC (22 ). В настоящем исследовании мы сообщаем, что HSV-1 также воздействует на сигнальный путь IL-6 в мДК, препятствуя экспрессии IL6R. Путь передачи сигналов IL-6 включает связывание плейотропного цитокина IL-6 с его родственным рецепторным комплексом IL-6, состоящим из gp130 и компонента мембраносвязанного рецептора IL-6 (IL6R), и играет решающую роль во время миграции. провоспалительная передача сигналов и апоптоз (24, 25, 34).

  Данные, представленные в этом исследовании, демонстрируют, что уровни экспрессии IL6R были значительно снижены на мДК, инфицированных HSV-1, по сравнению с ложным контролем уже через 4 часа на дюйм, с почти полной потерей IL6R на поверхности клетки через 24 часа на дюйм (рис. 1А, зеленая линия). Модуляция экспрессии IL6R была также верна для уровней внутриклеточного белка (рис. 1B). Примечательно, что проточно-цитометрический анализ дополнительно выявил значительное нарушение поверхностной экспрессии IL6R на GFP-отрицательных сторонних mDC (рис. 1A, синяя линия).По сравнению с мДК, непосредственно инфицированными ВПГ-1, поверхностная экспрессия IL6R на случайных мДК была снижена с задержкой по времени и менее выражена по сравнению с мДК с ложной инфекцией. Кроме того, уровни экспрессии мРНК IL6R были снижены уже на 2 hpi, что указывает на опосредованную HSV-1 регуляцию транскрипции с очень быстрой кинетикой (рис. 1C). Регулирование экспрессии мРНК также было значительным в GFP-отрицательных мДК-свидетелях 16 hpi, однако, и в соответствии с уровнями белка (Рисунок 1A), менее выраженным, чем в GFP-положительных клетках (Рисунок 1D).

  Эксперименты по кокультуре, проведенные в настоящем исследовании, показали, что непосредственно инфицированные HSV-1 mDC высвобождают de novo продуцируемых факторов в супернатант, которые индуцируют модуляцию IL6R на сторонних mDC (рис. 2A). В этом отношении следует отметить, что вирусные компоненты в супернатантах не фагоцитируются неинфицированными посторонними мДК (рис. 3). Наше открытие, что инокуляция mDCs УФ-инактивированными вирионами также препятствует поверхностной экспрессии IL6R, свидетельствует о том, что вирусная репликация не является абсолютно необходимой для наблюдаемого снижения уровней поверхностной экспрессии IL6R, опосредованного HSV-1.Это говорит о том, что вирусных белков, включенных в вирионы, достаточно, чтобы частично опосредовать наблюдаемый эффект (рис. 4).

  Недавняя публикация показывает, что из-за внутреннего ингибирования аутофагического обмена и, следовательно, деградации ламина, капсиды HSV-1 захватываются в ядре mDC, и, таким образом, mDC, инфицированные HSV-1, преимущественно выделяют неинфекционные L-частицы (13). . Было описано, что эти L-частицы подавляют регуляцию функционально важных поверхностных молекул, таких как CD83, на неинфицированных посторонних мДК (16).Как правило, L-частицы, за исключением капсида и, следовательно, вирусного генома, собираются аналогично зрелым вирионам (57, 58). Что касается этого, синтез de novo L-частиц непосредственно инфицированными HSV-1 мДК может объяснить отложенное по времени начало модуляции IL6R на клеточной поверхности неинфицированных случайных мДК (рис. 1A, синяя линия). Наше открытие, что экспрессия IL6R также влияет на GFP-отрицательные сторонние mDC в контексте инфекции с использованием чистых H-частиц (MOI 0.65), поддерживает гипотезу о том, что L-частицы ответственны за эту регуляцию IL6R. Поскольку обработка mDC чистыми H-частицами (зрелыми вирионами) снижает поверхностную экспрессию IL6R на сторонних mDC по сравнению с ложно инфицированными mDC, мы исключили возможность того, что наблюдаемые эффекты IL6R на сторонние mDC связаны с L-частицами, содержащимися в Исходные препараты HSV-1 (рис. 5B, «H-частицы»). Недавно Рассел и др. . показали, что L-частицы, полученные из клеток HaCaT, инфицированных штаммом HSV-1 Sc16, или клеток MDBK, инфицированных штаммом P8-2 BoHV-1, содержат множество вирусных белков тегумента и подавляющее большинство вирусных гликопротеинов (59).Учитывая общую гомологию между различными штаммами HSV-1 (60), очень вероятно, что L-частицы, полученные из штамма HSV-1 syn 17 + / CMV-EGFP / UL43-инфицированных мДК, похожи на состав мДК частицы, сообщаемые другими (59, 61, 62). Недавно мы проанализировали состав L-частиц, полученных из мДК, инфицированных HSV-1, а также из клеток BHK21 с помощью масс-спектрометрии и обнаружили широкий спектр вирусных белков, включенных в L-частицы, полученные из любого из обоих типов клеток (63). . Несмотря на заблокированную продукцию H-частиц мДК, инфицированными HSV-1, мы предполагаем, что L-частицы продуцируются и высвобождаются для переноса различных белков, кодируемых HSV-1, в клеточное микроокружение и для формирования клеток-свидетелей в пользу вирус.Другой тип частиц, образующихся во время инфекции HSV-1, — это так называемые дефектные интерферирующие частицы (DIP), которые возникают спонтанно и, таким образом, содержатся в вирусных запасах множественных пассажей (64). Из-за мутаций в вирусном геноме DIP сами по себе неспособны к репликации, но все же содержат вирусную ДНК (65). Основываясь на предыдущей публикации, вирусный капсид и, следовательно, вирусный геном задерживаются внутри ядра мДК, инфицированных HSV-1. Следовательно, мДК высвобождают только L-частицы, лишенные генома (13).Следовательно, более вероятно, что L-частицы вызывают наблюдаемую модуляцию IL6R, а не ДНК, содержащие DIP.

  Однако очень мало было известно о L-частицах, генерируемых mDC, включая то, как они переносятся и модулируют клетки-свидетели во время инфекции. Здесь мы впервые предоставляем экспериментальные доказательства того, что L-частицы ответственны за модуляцию IL6R на незараженных сторонних мДК. Чтобы еще раз доказать, что переносимые L-частицы ответственны за этот эффект, мы ингибировали перенос L-частиц в посторонние мДК с помощью специфических антител против gB (49, 50).В общем, HSV проникает в свои клетки-хозяева различными путями проникновения, при этом основными путями проникновения являются pH-независимое слияние с плазматической мембраной клетки-хозяина (66) или вход, опосредованный эндоцитозом (67). Для проникновения вируса и его прикрепления к клетке-хозяину необходима поверхностная молекула gB (7, 51). Кроме того, mDC экспрессируют специфические рецепторы, такие как HVEM (68), PILRα (51) и DC-SIGN (53), с которыми связываются гликопротеины, специфичные для HSV-1, например, gB и gD, и тем самым индуцируют проникновение вируса в ячейку (69).Таким образом, применяли антитело, специфичное к gB, для ингибирования переноса и прикрепления частиц, производных от HSV-1. Подтверждая нашу гипотезу, это антитело препятствовало передаче высвобожденных L-частиц от инфицированных к неинфицированным посторонним мДК во время наших экспериментов по совместному заражению и ингибировало модуляцию IL6R на этих клетках (рис. 5C). Несмотря на это, наблюдаемые эффекты, вызванные HSV-1, на поверхностную экспрессию IL6R в основном регулируются H-частицами и в меньшей степени L-частицами.

  Чтобы исследовать, могут ли более низкие уровни поверхностной экспрессии IL6R быть следствием специфической регуляции мРНК при инфицировании мДК HSV-1, мы выполнили анализ qPCR транскриптов IL6R. Поскольку уровни экспрессии мРНК IL6R были значительно изменены HSV-1 (рис. 1C), мы использовали штамм HSV-1, удаленный для гена vhs, который кодирует вирусную мРНКазу (44, 45). Интересно, что снижение мРНК IL6R все еще происходило в мДК HSV-1, инфицированных Δvhs, но с задержкой по времени по сравнению с HSV-1 wt (Фигуры 1B, 6B).Вирусный белок vhs не только разрушает клеточную мРНК, чтобы отключить синтез белка хозяина, но также отрицательно влияет на вирусные мРНК, что обеспечивает быстрый переход между тремя фазами экспрессии генов HSV-1 (70). Кроме того, vhs ограничивает накопление дцРНК в клетках, инфицированных HSV-1 (71). Вирусный белок vhs активен сразу после высвобождения тегумента и на ранних стадиях инфицирования. Его активность затрудняется продолжающейся инфекцией из-за взаимодействия двух поздних белков VP22 и VP16 с vhs (72, 73).Таким образом, мы предполагаем, что в непосредственно инфицированных mDCs vhs действует на ранней стадии после инфицирования, модулируя уровни транскрипта IL6R (фигура 6A, зеленая линия, фигура 6B). Кроме того, модуляция поверхностной экспрессии IL6R на сторонних мДК была менее заметной при инфицировании HSV-1 Δvhs по сравнению с инфекцией HSV-1 wt (фигура 6A, синяя линия). Следовательно, мы заключаем, что vhs важен для регуляции IL6R в непосредственно инфицированных mDC в ранние моменты времени и более важен для модуляции IL6R на случайных mDC. Однако, основываясь на описанных множественных ролях vhs во время инфекции HSV-1, нельзя исключить, что vhs влияет на поверхностную экспрессию IL6R косвенным образом.

  В заключение, настоящее исследование дополняет недавние сообщения о том, как HSV-1 влияет на экспрессию отдельных белков в mDC. В соответствии с предыдущими результатами по экспрессии CD83, мы здесь сообщаем, что поверхностная экспрессия IL6R в mDC, по сравнению с фиктивным контролем, также снижается не только на непосредственно инфицированных HSV-1, но также и на неинфицированных сторонних mDC. Мы также предоставляем первые экспериментальные доказательства того, что L-частицы, полученные из HSV-1, генерируемые непосредственно инфицированными HSV-1 mDC, отрицательно влияют на поверхностную экспрессию IL6R на mDC, а также учитывают потерю на сторонних mDC в экспериментах по совместному культивированию (Рисунок 7). .Мы идентифицировали кодируемую вирусом мРНКазу vhs как индуктор деградации мРНК IL6R и, в свою очередь, модуляции поверхностного белка, особенно в / на случайных мДК. Таким образом, мы предполагаем, что L-частицы, полученные из HSV-1, содержат и переносят важные вирусные белки, такие как vhs (14, 63), для формирования клеточного микроокружения. Эти объединенные данные подчеркивают, что L-частицы отражают способ обхода ограничения полной репликации в мДК и представляют собой сложную стратегию того, как ВПГ-1 поддерживает инфекцию транс соседних клеток и препятствует индукции противовирусного иммунного ответа (14, 15 ).

  Рисунок 7 . Схема модуляции IL6R на мДК, инфицированных вирусом простого герпеса-1 и сторонних наблюдателях. Слева: HSV-1 эффективно инфицирует мДК и модулирует экспрессию IL6R на напрямую инфицированных мДК. В mDC производство инфекционных зрелых вирионов (H-частиц) подавляется при инфицировании HSV-1, так как вновь собранные капсиды захватываются ядром. Таким образом, мДК, инфицированные HSV-1, могут генерировать только неинфекционные L-частицы без капсида. Справа: L-частицы высвобождаются мДК, инфицированными ВПГ-1, и модулируют посторонние мДК, например.g., экспрессия IL6R. В этом отношении белки-тегументы, такие как vhs, которые также связаны с L-частицами, способны проникать в клетки-свидетели и вмешиваться в них.

  Заявление о доступности данных

  Все наборы данных, созданные для этого исследования, включены в статью / дополнительный материал.

  Заявление об этике

  Исследования с участием людей были рассмотрены и одобрены Комиссией по этике Фридриха-Александра-Университета Эрлангена-Нюрнберга.Пациенты / участники предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании.

  Авторские взносы

  Концептуализация этого проекта была проведена AB, LP, CH и AS. Эксперименты проводили AB, PM-Z, CD и CK. Данные были подтверждены AB, LP, CH, AK и AS. Формальный анализ, визуализация были выполнены, и первоначальный проект был подготовлен AB. Рукопись была рецензирована и отредактирована LP, CH, AK и AS. Надзор и администрирование проекта осуществляли LP, CH и AS.Финансирование было осуществлено AS и LP. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

  Финансирование

  Это исследование финансировалось Немецким исследовательским фондом (Deutsche Forschungsgemeinschaft – DFG), грант № STE 432 / 11-1, предоставленный AS. AB был поддержан программой ELAN Universitätsklinikum Erlangen, предоставленной LP (грант № 18-12-21-1). АК был поддержан Фондом Рудольфа Аккермана. AB был поддержан финансируемым DFG GRK2504.

  Конфликт интересов

  Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

  Благодарности

  Мы выражаем признательность за поддержку в рамках программы финансирования Open Access Publishing, проводимой Университетом Фридриха-Александра в Эрлангене-Нюрнберге (FAU). Мы благодарим Core Unit Cell Sorting and Immunomonitoring (Universitätsklinikum Erlangen) и AG Nimmerjahn (Отдел генетики, Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg) за сортировку клеток.

  Сокращения

  BHK, Почки детенышей хомячка; RT — комнатная температура; ICP, белок инфицированных клеток; FCS, Фетальная телячья сыворотка; ЭДТА, этилендиаминтетраацетат; CCR, тип хемокинового рецептора C-C; CXCR, тип хемокинового рецептора C-X-C; CCL, хемокиновый лиганд C-C; CXCL, хемокиновый лиганд C-X-C; CD, Кластер дифференциации; MOI, множественность инфекции; MES, 2- (N-морфолино) этансульфоновая кислота; GM-CSF, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; ИЛ-4, интерлейкин-4; EGFP, усиленный зеленый флуоресцентный белок; ЦМВ, цитомегаловирус; LRSC, камеры системы лейкоредукции; hpi — час (а) после заражения; UL, уникальный длинный.

  Список литературы

  2. Чжоу Л.Дж., Теддер Т.Ф. Дендритные клетки крови человека избирательно экспрессируют CD83, член суперсемейства иммуноглобулинов. Дж. Иммунол . (1995) 154: 3821–35.

  PubMed Аннотация | Google Scholar

  3. Кавамура К., Ийонага К., Ичиясу Х., Нагано Дж., Суга М., Сасаки Ю. Дифференциация, созревание и выживание дендритных клеток за счет регуляции остеопонтина. Clin Diagn Lab Immunol . (2005) 12: 206–12. DOI: 10.1128 / CDLI.12.1.206-212.2005

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  4. Humrich JY, Humrich JH, Averbeck M, Thumann P, Termeer C, Kämpgen E, et al. Зрелые дендритные клетки, происходящие из моноцитов, сильнее реагируют на CCL19, чем на CXCL12: последствия для направленной миграции. Иммунология . (2006) 117: 238–47. DOI: 10.1111 / j.1365-2567.2005.02292.x

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  5. Ridge JP, Di Rosa F, Matzinger P. Условная дендритная клетка может быть временным мостом между CD4 + T-хелпером и T-киллером. Природа . (1998) 393: 474–8. DOI: 10.1038 / 30989

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  6. Laine RF, Albecka A, van de Linde S, Rees EJ, Crump CM, Kaminski CF. Структурный анализ вируса простого герпеса с помощью визуализации оптического сверхвысокого разрешения. Нац Коммуна . (2015) 6: 5980. DOI: 10.1038 / ncomms6980

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  8.Каструков Л.Ф., Лау А.С., Томас Э. Влияние линии мышей на инфекцию центральной нервной системы (ЦНС) вирусом простого герпеса 1 типа (ВПГ-1). Herpesviridae . (2012) 3: 4. DOI: 10.1186 / 2042-4280-3-4

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  9. Bauer KL, Steeil JC, Adkins EA, Childress AL, Wellehan JFXJr, Kerns KL, et al. Лечение инфекции глазного герпеса человека 1 у белолицых сакских обезьян (Pithecia pithecia). Comp Med .(2018) 68: 319–23. DOI: 10.30802 / AALAS-CM-17-000119

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  10. Смайли М.Л., Хокси Дж. А., Фридман Х. М.. Инфекция эндотелиальных, эпителиальных и фибробластных клеток вирусом простого герпеса 1 типа индуцирует рецептор для C3b. J Immunol. (1985) 134: 2673–8.

  PubMed Аннотация | Google Scholar

  11. Goldwich A, Prechtel AT, Mühl-Zürbes P, Pangratz NM, Stössel H, Romani N, et al. Вирус простого герпеса типа I (HSV-1) реплицируется в зрелых дендритных клетках, но может передаваться только в зависимости от контакта между клетками. Дж Лейкок Биол . (2011) 89: 973–9. DOI: 10.1189 / jlb.0310180

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  12. Гроше Л., Куммер М., Стейнкасерер А. Что происходит вокруг, то и происходит — репликация HSV-1 в дендритных клетках, происходящих из моноцитов. Передний микробиол . (2017) 8: 2149. DOI: 10. 3389 / fmicb.2017.02149

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  13. Туран А., Гроше Л., Кравчик А., Мюль-Цюрбес П., Драсснер С., Дюторн А. и др.Аутофагическая деградация ламинов способствует выходу из ядра вируса простого герпеса типа 1. J Cell Biol . (2019) 218: 508–23. DOI: 10.1083 / jcb.201801151

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  14. Маклаучлан Дж., Аддисон С., Крейги М.С., Риксон Ф.Дж. Неинфекционные L-частицы поставляют функции, которые могут способствовать заражению HSV-1. Вирусология . (1992) 190: 682–8. DOI: 10.1016 / 0042-6822 (92)

  -6

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  15.Ibiricu I, Maurer UE, Grünewald K. Характеристика сборки и выхода L-частиц вируса простого герпеса типа 1 в нейронах гиппокампа с помощью электронной крио-томографии. Cell Microbiol . (2013) 15: 285–91. DOI: 10.1111 / cmi.12093

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  16. Heilingloh CS, Kummer M, Mühl-Zürbes P, Drassner C., Daniel C., Klewer M, et al. L-частицы передают вирусные белки от зрелых дендритных клеток, инфицированных вирусом простого герпеса 1, к неинфицированным клеткам-свидетелям, вызывая пониженную модуляцию CD83. J Virol. (2015) 89: 11046–55. DOI: 10.1128 / JVI.01517-15

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  17. Крузе М., Посориус О., Кретцер Ф., Стелц Г., Кунт С., Шулер Г. и др. Зрелые дендритные клетки, инфицированные вирусом простого герпеса 1 типа, проявляют способность к ингибированию стимуляции Т-клеток. Дж Вирол . (2000) 74: 7127–36. DOI: 10.1128 / JVI.74.15.7127-7136.2000

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  18.Kummer M, Turza NM, Mühl-Zürbes P, Lechmann M, Boutell C, Coffin RS и др. Вирус простого герпеса типа 1 вызывает деградацию CD83 в зрелых дендритных клетках с немедленной ранней кинетикой через клеточную протеасому J Virol . (2007) 81: 6326–38. DOI: 10.1128 / JVI.02327-06

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  19. Де Гассарт А., Камоссето В., Тибодо Дж., Сеппи М., Каталонский Н., Пьер П. и др. Стабилизация MHC класса II на поверхности дендритных клеток человека является результатом зависимого от созревания подавления MARCH I. Proc Natl Acad Sci USA. (2008) 105: 3491–6. DOI: 10.1073 / pnas.0708874105

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  20. Tze LE, Horikawa K, Domaschenz H, Howard DR, Roots CM, Rigby RJ, et al. CD83 увеличивает MHC II и CD86 на дендритных клетках, противодействуя IL-10-управляемому MARCh2-опосредованному убиквитинированию и деградации. J Exp Med . (2011) 208: 149–65. DOI: 10.1084 / jem.200

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  21.Prechtel AT, Turza NM, Kobelt DJ, Eisemann JI, Coffin RS, McGrath Y, et al. Заражение зрелых дендритных клеток вирусом простого герпеса 1 типа резко снижает лимфоидную хемокин-опосредованную миграцию. J Gen Virol. (2005) 86: 1645–1657. DOI: 10.1099 / vir.0.80852-0

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  22. Theodoridis AA, Eich C, Figdor CG, Steinkasserer A. Инфекция дендритных клеток вирусом простого герпеса типа 1 вызывает быструю деградацию CYTIP, тем самым модулируя адгезию и миграцию. Кровь . (2011) 118: 107–15. DOI: 10.1182 / кровь-2010-07-294363

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  23. Роуз-Джон С., Шеллер Дж., Элсон Дж., Джонс С.А. Биология интерлейкина-6 координируется мембраносвязанными и растворимыми рецепторами: роль в воспалении и раке. Дж Лейкок Биол . (2006) 80: 227–36. DOI: 10.1189 / jlb.1105674

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  24. Шеллер Дж., Чаларис А., Шмидт-Аррас Д., Роуз-Джон С.Про- и противовоспалительные свойства цитокина интерлейкина-6. Biochim Biophys Acta . (2011) 1813: 878–88. DOI: 10.1016 / j.bbamcr. 2011.01.034

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  28. Meley D, Heraud A, Gouilleux-Gruart V, Ivanes F, Velge-Roussel F. Тоцилизумаб способствует воспалительному статусу зрелых дендритных клеток посредством модуляции субъединиц рецептора интерлейкина-6. Фронт Иммунол . (2017) 8: 926. DOI: 10.3389 / fimmu.2017.00926

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  29. Verboogen DRJ, Revelo NH, Ter Beest M, van den Bogaart G. Секреция интерлейкина-6 ограничена самосигналом в эндосомах. Дж. Mol Cell Biol . (2019) 11: 144–57. DOI: 10.1093 / jmcb / mjy038

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  30. Шумахер Н., Мейер Д., Мауэрманн А., фон дер Хейде Дж., Вольф Дж., Шварц Дж. И др. Выделение эндогенного рецептора интерлейкина-6 (IL-6R) регулируется протеазами дезинтегрина и металлопротеиназы (ADAM), в то время как полноразмерная изоформа IL-6R локализуется в циркулирующих микровезикулах. J Biol Chem. (2015) 290: 26059–71. DOI: 10.1074 / jbc.M115.649509

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  31. Lokau J, Agthe M, Garbers C. Генерация растворимых рецепторов интерлейкина-11 и интерлейкина-6: важная функция протеаз во время воспаления. Медиаторы воспаления . (2016) 2016: 1785021. DOI: 10.1155 / 2016/1785021

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  32. Мацуо К., Ока М., Мурасе К., Сода Х, Исомото Х., Такешима Ф. и др.Экспрессия интерлейкина 6 и его рецептора при раке желудка и толстой кишки у человека. J Int Med Res . (2003) 31: 69–75. DOI: 10.1177 / 147323000303100202

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  33. Briso EM, Dienz O, Rincon M. Передовая кромка: растворимый IL-6R продуцируется отщеплением эктодомена IL-6R в активированных Т-клетках CD4. Дж. Иммунол . (2008) 180: 7102–6. DOI: 10.4049 / jimmunol.180.11.7102

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  34. Сунь В., Лю Д.Б., Ли В.В., Чжан Л.Л., Лонг Г.Х., Ван Дж.Ф. и др. Интерлейкин-6 способствует миграции и инвазии клеточных линий карциномы носоглотки и усиливает экспрессию MMP-2 и MMP-9. Инт Дж. Онкол . (2014) 44: 1551–60. DOI: 10.3892 / ijo.2014.2323

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  35. Ван Ц., Чен Х, Фенг Дж., Цао И, Сон И, Ван Х и др. Врожденный иммунный ответ, опосредованный растворимым рецептором интерлейкина-6, на ДНК- и РНК-вирусы. Дж Вирол .(2013) 87: 11244–54. DOI: 10.1128 / JVI.01248-13

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  36. Веласкес-Салинас Л., Вердуго-Родригес А., Родригес Л.Л., Борка М.В. Роль интерлейкина 6 при вирусных инфекциях. Передний микробиол . (2019) 10: 1057. DOI: 10.3389 / fmicb.2019.01057

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  37. Wang J, Wang Q, Han T., Li YK, Zhu SL, Ao F, et al. Уровень растворимого рецептора интерлейкина-6 повышается во время инфицирования вирусом гриппа А и опосредует выброс воспалительных цитокинов IL-6 и IL-32. Cell Mol Immunol . (2015) 12: 633–44. DOI: 10.1038 / cmi.2014.80

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  38. Чанг З, Ван И, Бянь Л., Лю Цюй, Лун Дж. Энтеровирус 71 противодействует противовирусной активности хозяина STAT3 и IL-6R с частичной зависимостью от индуцированной вирусом miR-124. Дж. Ген Вирол . (2017) 98: 3008–25. DOI: 10.1099 / jgv.0.000967

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  39. Чанг З, Ван И, Чжоу Х, Лонг Дж.Роль STAT3 в вирусной инфекции: противовирусный или провирусный? Вирол будущего . (2018) 13: 557–74. DOI: 10.2217 / fvl-2018-0033

  CrossRef Полный текст | Google Scholar

  40. Рока Суарес А.А., Ван Ренн Н., Баумерт Т.Ф., Лупбергер Дж. Вирусные манипуляции с STAT3: уклонение, использование и нанесение вреда. PLoS Pathog . (2018) 14: e1006839. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1006839

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  41. Браун С.М., Ричи Д.А., Субак-Шарп Дж. Х.Генетические исследования с вирусом простого герпеса типа 1. Выделение чувствительных к температуре мутантов, их расположение в группы комплементации и рекомбинационный анализ, приводящий к карте сцепления. J General Virol. (1973) 18: 329–46. DOI: 10.1099 / 0022-1317-18-3-329

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  42. Гроб Р.С., Маклин А.Р., Лэтчман Д.С., Браун С.М. Доставка гена в центральную и периферическую нервную систему мышей с использованием мутантных векторов с делецией HSV1 ICP34.5. Джин Тер . (1996) 3: 886–91.

  PubMed Аннотация | Google Scholar

  43. Coffin RS, Thomas SK, Thomas NS, Lilley CE, Pizzey AR, Griffiths CH, et al. Чистые популяции трансдуцированных первичных клеток человека могут быть получены с использованием векторов вируса герпеса, экспрессирующих GFP, и проточной цитометрии. Джин Тер . (1998) 5: 718–22. DOI: 10.1038 / sj.gt.3300634

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  44. Рид Г.С., Френкель Н. Мутанты вируса простого герпеса, дефектные в связанном с вирионом отключении синтеза полипептидов хозяина и демонстрирующие аномальный синтез альфа (немедленных ранних) вирусных полипептидов. Дж Вирол . (1983) 46: 498–512. DOI: 10.1128 / JVI.46.2.498-512.1983

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  46. Гроше Л., Дёнер К., Дюторн А., Хикфорд-Мартинес А., Стейнкасерер А., Содейк Б. Распространение вируса простого герпеса типа 1, титрование и пошаговые кривые роста. Биопротокол . (2019) 9: e3441. DOI: 10.21769 / BioProtoc.3441

  CrossRef Полный текст | Google Scholar

  47. Szilágyi JF, Cunningham C. Идентификация и характеристика новой неинфекционной частицы, связанной с вирусом простого герпеса. Дж. Ген Вирол . (1991) 72: 661–8. DOI: 10.1099 / 0022-1317-72-3-661

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  48. Пфайффер И.А., Зинзер Э., Штрассер Э., Штейн М. Ф., Дёрри Дж., Шафт Н. и др. Камеры системы лейкоредукции являются эффективным, надежным и экономичным источником функциональных дендритных клеток и лимфоцитов, полученных из моноцитов. Иммунобиология . (2013) 218: 1392–401. DOI: 10.1016 / j.imbio.2013.07.005

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  49.Krawczyk A, Krauss J, Eis-Hubinger AM, Daumer MP, Schwarzenbacher R, Dittmer U, et al. Влияние валентности моноклональных антител, специфичных к гликопротеину B, на нейтрализацию вируса простого герпеса. J Virol. (2011) 85: 1793–803. DOI: 10.1128 / JVI.01924-10

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  50. Krawczyk A, Arndt MA, Grosse-Hovest L, Weichert W., Giebel B, Dittmer U, et al. Преодоление лекарственно-устойчивого вируса простого герпеса (ВПГ) с помощью гуманизированных антител. Proc Natl Acad Sci USA . (2013) 110: 6760–5. DOI: 10.1073 / pnas.1220019110

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  51. Сато Т., Ари Дж., Суэнага Т., Ван Дж., Когуре А., Уехори Дж. И др. PILRalpha представляет собой корецептор входа вируса простого герпеса-1, который связывается с гликопротеином B. Cell . (2008) 132: 935–44. DOI: 10.1016 / j.cell.2008.01.043

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  52. Фурнье Н., Чалус Л., Дюран I, Гарсиа Э, Пин J-J, Чуракова Т. и др.FDF03, новый рецептор-ингибитор суперсемейства иммуноглобулинов, экспрессируется дендритными и миелоидными клетками человека. J Immunol. (2000) 165: 1197–209. DOI: 10.4049 / jimmunol.165.3.1197

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  53. де Йонг М., де Витте Л., Больмштедт А., ван Койк Ю., Гейтенбек ТБХ. Дендритные клетки опосредуют инфицирование вирусом простого герпеса и передачу через лектин C-типа DC-SIGN. Дж. Ген Вирол . (2008) 89: 2398–409.DOI: 10.1099 / vir.0.2008 / 003129-0

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  54. Трговчич Дж., Джонсон Д., Ройзман Б. Белки класса II главного комплекса гистосовместимости клеточной поверхности регулируются продуктами генов гамма (1) 34.5 и U (L) 41 вируса простого герпеса 1. J Virol . (2002) 76: 6974–86. DOI: 10.1128 / JVI.76.14.6974-6986.2002

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  55. Neumann J, Eis-Hübinger AM, Koch N.Вирус простого герпеса типа 1 нацелен на путь обработки MHC класса II для уклонения от иммунитета. Дж. Иммунол . (2003) 171: 3075–83. DOI: 10.4049 / jimmunol.171.6.3075

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  56. Temme S, Eis-Hubinger AM, McLellan AD, Koch N. Гликопротеин B, кодируемый вирусом простого герпеса-1, направляет HLA-DR в путь экзосомы. Дж. Иммунол . (2010) 184: 236–43. DOI: 10.4049 / jimmunol.02

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  57.Rixon FJ, Addison C, McLauchlan J. Сборка покрытых оболочкой структур тегумента (L-частицы) может происходить независимо от созревания вириона в клетках, инфицированных вирусом простого герпеса 1 типа. Дж. Ген Вирол . (1992) 73: 277–84. DOI: 10.1099 / 0022-1317-73-2-277

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  58. Алеманн Н., Кирога М. И., Лопес-Пенья М., Васкес С., Герреро Ф. Х., Ньето Дж. М.. Продукция L-частиц во время первичной репликации вируса псевдобешенства в слизистой оболочке носа свиней. Дж Вирол . (2003) 77: 5657–7. DOI: 10.1128 / JVI.77.10.5657-5667.2003

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  59. Рассел Т., Блисдейл Б., Холлинсхед М., Эллиотт Г. Качественные различия в бескапсидных L-частицах, высвобождаемых как побочный продукт инфекций, вызванных вирусом герпеса 1 крупного рогатого скота и вирусом простого герпеса 1. Дж Вирол . (2018) 92, e01259–01218. DOI: 10.1128 / JVI.01259-18

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  60. Уотсон Г., Сюй В., Рид А., Бабра Б., Путман Т., Вик Е. и др. Последовательность и сравнительный анализ генома штамма HSV-1 McKrae. Вирусология . (2012) 433: 528–37. DOI: 10.1016 / j.virol.2012.08.043

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  62. Loret S, Lippé R. Биохимический анализ полипептида инфицированных клеток (ICP) 0, ICP4, UL7 и UL23, включенных во внеклеточные вирионы вируса простого герпеса типа 1. Дж. Ген Вирол . (2012) 93: 624–34.DOI: 10.1099 / vir.0.039776-0

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  63. Бирцер А., Кранер М.Э., Хейлингло С.С., Мюль-Цюрбес П., Хофманн Дж., Стейнкасерер А. и др. Масс-спектрометрическая характеристика L-частиц HSV-1 из дендритных клеток человека и клеток BHK21 и анализ их функциональной роли. Front Microbiol. (2020). DOI: 10.3389 / fmicb.2020.01997

  CrossRef Полный текст

  64. Коул С. Н., Смлер Д., Виммер Е., Балтимор Д.Дефектные мешающие частицы полиовируса. I Изоляция и физические свойства. Дж Вирол . (1971) 7: 478–85. DOI: 10.1128 / JVI.7.4.478-485.1971

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  65. Ян И, Лю Т., Чжоу Р., Хе Х, Е К., Се Ц. и др. Противовирусные и противоопухолевые эффекты дефектных мешающих частиц / геномов и их механизмы. Front Microbiol. (2019) 10: 1852. DOI: 10.3389 / fmicb.2019.01852

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  66.Виттелс М., Копье П.Г. Для проникновения вируса простого герпеса в клетки не требуется эндоцитозный путь с низким уровнем pH. Virus Res . (1991) 18: 271–90. DOI: 10.1016 / 0168-1702 (91)

  -P

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  67. Клемент С., Тивари В., Сканлан П.М., Валый-Надь Т., Юэ Б.А., Шукла Д. Новая роль фагоцитозоподобного поглощения при проникновении вируса простого герпеса. Дж. Ячейка Биол . (2006) 174: 1009–21. DOI: 10.1083 / jcb.200509155

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  68. Салио М., Селла М., Сутер М., Ланзавеккья А. Ингибирование созревания дендритных клеток вирусом простого герпеса. Eur J Immunol . (1999) 29: 3245–3253. DOI: 10.1002 / (SICI) 1521-4141 (199910) 29:10 <3245 :: AID-IMMU3245> 3.0.CO; 2-X

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  70. Kwong AD, Frenkel N. Клетки, инфицированные вирусом простого герпеса, содержат функцию (ы), которая дестабилизирует мРНК как хозяина, так и вируса. Proc Natl Acad Sci USA . (1987) 84: 1926–30.DOI: 10.1073 / pnas.84.7.1926

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  71. Даубер Б., Саффран Х.А., Смайли-младший. РНКаза выключения хозяина вируса простого герпеса (vhs) ограничивает накопление двухцепочечной РНК в инфицированных клетках: свидетельство ускоренного распада дуплексной РНК. PLoS Pathog . (2019) 15: e1008111. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1008111

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  72. Шу М., Таддео Б., Чжан В., Ройзман Б.Селективная деградация мРНК закрывающей РНКазой хозяина HSV регулируется белком тегумента UL47. Proc Natl Acad Sci USA . (2013) 110: E1669–1675. DOI: 10.1073 / pnas.1305475110

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  73. Даубер Б., Саффран Х.А., Смайли-младший. Белок отключения хозяина вириона вируса простого герпеса 1 усиливает трансляцию вирусных поздних мРНК, предотвращая перегрузку мРНК. J Virol. (2014) 88: 9624–32. DOI: 10.1128 / JVI.01350-14

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  Аутокринная активация STAT3 при ВПЧ-положительном раке шейки матки через сигнальную ось Akt — NFκB — IL-6, управляемую вирусом

  Abstract

  Персистирующая инфекция вируса папилломы человека (ВПЧ) является ведущей причиной рака шейки матки. Хотя фундаментальная связь между инфекцией ВПЧ и онкогенезом установлена, конкретные механизмы вирусной трансформации остаются малоизученными. Ранее мы продемонстрировали, что белок Е6, кодируемый ВПЧ, увеличивает активность протоонкогенного фактора транскрипции STAT3 в первичных кератиноцитах человека; однако молекулярная основа активации STAT3 при раке шейки матки остается неясной.Здесь мы показываем, что фосфорилирование STAT3 в ВПЧ-положительных клетках рака шейки матки опосредуется, главным образом, аутокринной активацией провоспалительным цитокином Интерлейкин 6 (IL-6). Опосредованная антителами блокада передачи сигналов IL-6 в HPV-положительных клетках ингибирует фосфорилирование STAT3, тогда как как рекомбинантный IL-6, так и кондиционированная среда из HPV-положительных клеток приводит к усилению фосфорилирования STAT3 в HPV-отрицательных клетках рака шейки матки. Интересно, что мы демонстрируем, что нетрадиционная активация фактора транскрипции NFκB с участием протеинкиназы Akt необходима для продукции IL-6 и последующей активации STAT3.Наши данные позволяют по-новому взглянуть на молекулярную перестройку раковых клеток под действием ВПЧ E6. Мы обнаружили, что активация сигнальной оси IL-6 управляет аутокринным и паракринным фосфорилированием STAT3 в клетках рака шейки матки, положительных по отношению к ВПЧ. Более глубокое понимание этого пути дает потенциальную возможность использования существующих клинически одобренных лекарств для лечения рака шейки матки, опосредованного ВПЧ.

  Об авторе Хроническая инфекция ВПЧ является преобладающей причиной аногенитального рака и рака полости рта.Трансформация требует перенастройки сигнальных путей в инфицированных клетках кодируемыми вирусом онкобелками. На данный момент все еще отсутствует полное понимание всего спектра путей хозяина, необходимых для опосредованного ВПЧ канцерогенеза. В этом исследовании мы описываем сигнальную цепь, приводящую к аберрантной продукции цитокина IL-6. Опосредованный онкопротеином Е6 ВПЧ, он требует активации фактора транскрипции NFκB. Аутокринное и паракринное действие IL-6 имеет важное значение для активации STAT3 при HPV-положительном раке шейки матки. Это исследование дает молекулярную информацию о механизмах, с помощью которых онкопротеин, кодируемый вирусом, активирует онкогенный путь, и освещает потенциальные цели для терапевтического вмешательства.

  Введение

  Вирусы папилломы человека (ВПЧ) являются основной причиной плоскоклеточного рака аногенитального и ротоглоточного эпителия [1]. ВПЧ высокого риска (ВПЧ-ВПЧ), примером которых являются ВПЧ 16 и 18, ответственны за> 99% рака шейки матки и от 30 до 70% рака ротоглотки [2].HPV кодирует три онкогенных белка: E5, E6 и E7, которые манипулируют сигнальными путями, необходимыми для клеточной трансформации. К ним относятся: рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) [3-5], Wnt [6, 7] и передача сигналов Hippo [8]. Мембранный белок E5 активирует передачу сигналов EGFR [9] по механизму, связанному с активностью его кодируемого вирусом ионного канала (виропорина) [3, 10, 11]. HPV E6 образует комплексы с убиквитин-лигазами E3 хозяина и опосредует протеасомную деградацию белка-супрессора опухоли p53, а также увеличивает активность теломеразы для предотвращения апоптоза и иммортализации инфицированных клеток [12]. Онкобелок E7 стимулирует реакцию на повреждение ДНК, стимулируя репликацию вируса и геномную нестабильность, одновременно способствуя прогрессированию клеток через S-фазу клеточного цикла [13, 14].

  Преобразователь сигнала фактора транскрипции и активатор транскрипции (STAT) 3 является важным регулятором клеточной пролиферации, дифференцировки и выживания [15]. Это онкоген bona fide , и его аберрантная активация наблюдается при растущем числе злокачественных новообразований [16].Таким образом, STAT3 стал привлекательной терапевтической мишенью для лечения различных видов рака, включая плоскоклеточный рак мочевого пузыря, яичников, головы и шеи (HNSCC) [17].

  Онкогенные вирусы могут активировать STAT3, чтобы управлять клеточной пролиферацией, необходимой для репликации вируса и опухолеобразования [18]. Используя модель первичной культуры клеток кератиноцитов, мы ранее продемонстрировали, что E6 активирует передачу сигналов STAT3 во время продуктивного жизненного цикла HPV [19]. Активация STAT3 была существенной для гиперплазии, наблюдаемой в моделях культивирования рафтов кератиноцитов, содержащих ВПЧ.Повышенная экспрессия и фосфорилирование белка STAT3 также коррелировали с прогрессированием заболевания шейки матки в панели цитологических образцов [19]. Хотя мы определили, что Janus kinase 2 (JAK2) и MAP киназы необходимы для фосфорилирования STAT3 в первичных кератиноцитах, содержащих HPV, наше понимание механизмов, с помощью которых E6 опосредует этот процесс, остается неполным. Более того, механизмы, лежащие в основе активации STAT3 в клетках рака шейки матки, также не имеют полного понимания, тогда как ингибирование активности STAT3 приводит к глубокому снижению клеточной пролиферации и индукции апоптоза [20, 21].

  Ряд внеклеточных стимулов, включая цитокины и факторы роста, индуцируют фосфорилирование STAT3 и передачу сигналов [17]. Это требует фосфорилирования тирозина 705 (Y705) и серина 727 (S727), что приводит к димеризации STAT3 и ядерной транслокации, где он способен регулировать экспрессию генов [16]. В частности, члены семейства цитокинов IL-6 являются ключевыми медиаторами активации STAT3 за счет их взаимодействия с корецептором gp130 [22].

  Здесь мы показываем, что ВПЧ-положительные клетки рака шейки матки имеют более высокий уровень фосфорилированного белка STAT3 по сравнению с клетками, которые являются ВПЧ-отрицательными.Это происходит в результате увеличения продукции и высвобождения IL-6, что приводит к аутокринной и паракринной активации STAT3 через сигнальный путь, требующий корецептора IL-6 gp130. Кроме того, мы показываем, что продукция IL-6 контролируется E6-опосредованной стимуляцией передачи сигналов NF-κB, которая, по-видимому, частично зависит от неканонической активации пути, требующего протеинкиназы Akt. Наконец, мы демонстрируем корреляцию между экспрессией IL-6 и прогрессированием заболевания шейки матки, предполагая, что нацеливание на путь IL-6 для предотвращения активации STAT3 может иметь терапевтические преимущества при раке шейки матки.

  Результаты

  Экспрессия и фосфорилирование белка STAT3 увеличены в HPV-положительных по сравнению с HPV-отрицательными клетками рака шейки матки

  Чтобы установить эталон для HPV-опосредованного увеличения фосфорилирования STAT3, мы сначала проанализировали уровень фосфорилирования STAT3 в группе из шести клеточные линии рака шейки матки. К ним относятся две отрицательные линии HPV (HPV-) (C33A и DoTc2), две положительные линии HPV16 (HPV16 +; SiHa и CaSKi) и две положительные линии HPV18 (HPV18 +; SW756 и HeLa).Раковые клетки HPV16 + и HPV18 + демонстрировали более высокий уровень фосфорилирования STAT3 в обоих (Y705 и S727) сайтах по сравнению с клеточными линиями HPV- (значимо для SiHa, CaSKi и HeLa, p <0,05). Кроме того, общее количество STAT3 было увеличено в клетках рака шейки матки HPV + по сравнению с клетками рака шейки матки HPV (рис. 1A и B). Вместе эти данные демонстрируют повышенную экспрессию и фосфорилирование STAT3 в HPV + по сравнению с вирус-отрицательными клетками рака шейки матки.

  Рисунок 1.Фосфорилирование STAT3 выше в клетках рака шейки матки HPV + по сравнению с HPV-.

  A) Типичный вестерн-блоттинг из шести клеточных линий рака шейки матки — двух HPV- (C33A и Dotc2 4510), двух HPV16 + (SiHa и CaSKi) и HPV18 + (SW756 и HeLa) — для экспрессии фосфорилированных (Y705 и S727 ) и всего STAT3. GAPDH служил контролем загрузки. Данные представляют не менее трех биологических независимых повторов. B) Количественная оценка интенсивности полос белка в A) , стандартизованных по уровням GAPDH.Столбцы представляют собой средние значения ± стандартное отклонение от 3 независимых биологических повторов. * P <0,05 (t-критерий Стьюдента).

  Секретируемый фактор в среде клеток HPV + может индуцировать фосфорилирование STAT3 в клетках HPV-цервикального рака

  Учитывая, что STAT3 часто регулируется внеклеточными сигналами, мы исследовали, способствует ли HPV секреции факторов, способных индуцировать фосфорилирование STAT3. Клетки C33A (HPV-), инкубированные с кондиционированной средой (CM) из клеток HeLa (HPV18 +), демонстрировали заметное фосфорилирование STAT3 как по остаткам Y705, так и по S727, достигая пика между 30 минутами и 1 часом (фиг. 2A).Аналогичные результаты наблюдались с CaSKi-CM (HPV16 +) (рис. 2B). Соответственно, HeLa или CaSKi-CM индуцировали повышенное ядерное накопление STAT3 в клетках C33A (рис. 2C и D). Эти данные показывают, что фактор, секретируемый в среду из HPV + клеток, индуцирует фосфорилирование STAT3 в клетках-мишенях.

  Рис. 2. Фактор, секретируемый ВПЧ + клетками рака шейки матки, может индуцировать фосфорилирование STAT3 в клетках рака шейки матки ВПЧ.

  A-B) Клетки C33A голодали по сыворотке в течение 24 часов и добавляли кондиционированную среду из A) HeLa или B) клеток CaSKi на указанные моменты времени.В качестве контроля к клеткам добавляли среду, кондиционированную C33A, на 2 часа (M на рисунке). Представленный вестерн-блот показывает клеточные лизаты, проанализированные на экспрессию фосфорилированного и общего STAT3. GAPDH служил контролем загрузки. Данные представляют не менее трех биологических независимых повторов. C-D) Клетки C33A не содержали сыворотки в течение 24 часов и инкубировали с кондиционированной средой от C) HeLa или D) клеток CaSKi в течение 2 часов. В качестве контроля к клеткам добавляли среду, кондиционированную C33A, на 2 часа (M на рисунке).Клетки анализировали иммунофлуоресцентным окрашиванием на общий STAT3 (зеленый) и контрастировали с DAPI для выделения ядер (синий на объединенных панелях). Масштабная линейка 20 мкм.

  Секреция IL-6 повышена в клетках HPV + рака шейки матки

  Чтобы идентифицировать секретируемый фактор, ответственный за индуцирование фосфорилирования STAT3, мы сосредоточились на членах семейства провоспалительных цитокинов IL-6, поскольку они имеют хорошо изученную роль при активации STAT3 [23]. Во-первых, уровни экспрессии мРНК ключевых членов семейства были проанализированы с помощью RT-qPCR.Как в клетках HeLa, так и в клетках CaSKi уровни мРНК IL6, IL10, LIF (фактор ингибирования лейкемии) и OSM (онкостатин M) были значительно выше, чем в клетках C33A (рис. 3A), причем IL-6 показал наибольшую увеличивать. Основываясь на этом, мы проанализировали экспрессию мРНК IL-6 во всех шести линиях клеток рака шейки матки. В клетках рака шейки матки как HPV16 +, так и HPV18 + наблюдался значительно более высокий уровень экспрессии мРНК IL-6 по сравнению с клетками рака шейки матки HPV (рис. 3B), что коррелировало с внутриклеточной экспрессией белка IL-6 при анализе с помощью вестерн-блоттинга ( Рис 3C).Наконец, чтобы подтвердить, что обнаруженный белок ИЛ-6 секретируется, был проведен ИФА, специфичный к ИЛ-6. IL-6 не обнаруживался в культуральной среде клеток HPV; напротив, в культуральной среде клеток HPV16 + и HPV18 + можно было обнаружить значительное количество IL-6 (SiHa, p = 0,03; CaSKi, p = 0,0004; SW756, p = 0,03; HeLa, p = 0,00004). Эти данные предполагают, что экспрессия и секреция IL-6 намного выше в клетках рака шейки матки HPV + по сравнению с неинфицированными линиями.

  Рисунок 3. Уровень интерлейкина-6 (ИЛ-6) активируется в клетках рака шейки матки ВПЧ +.

  A) Уровень экспрессии цитокинов семейства IL-6 анализировали в клетках рака шейки матки HPV-, HPV16 + и HPV18 + с помощью qRT-PCR. Образцы были нормализованы по уровням мРНК U6. Репрезентативные данные представлены относительно клеток рака шейки матки HPV. Столбцы — это средние значения ± стандартное отклонение минимум трех биологических повторов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 (t-критерий Стьюдента). B) Экспрессия IL-6 из шести клеточных линий рака шейки матки — двух HPV- (C33A и Dotc2 4510), двух HPV16 + (SiHa и CaSKi) и HPV18 + (SW756 и HeLa) — анализировали с помощью qRT-PCR.Образцы были нормализованы по уровням мРНК U6. Репрезентативные данные представлены относительно клеток рака шейки матки HPV. Столбцы — это средние значения ± стандартное отклонение минимум трех биологических повторов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 (t-критерий Стьюдента). C) Типичный вестерн-блоттинг шести линий клеток рака шейки матки — двух HPV- (C33A и Dotc2 4510), двух HPV16 + (SiHa и CaSKi) и HPV18 + (SW756 и HeLa) — для экспрессии IL-6. GAPDH служил контролем загрузки.Данные представляют не менее трех биологических независимых повторов. D) Анализ ELISA из культуральной среды из шести линий клеток рака шейки матки — двух HPV- (C33A и Dotc2 4510), двух HPV16 + (SiHa и CaSKi) и HPV18 + (SW756 и HeLa) — на секретируемый белок IL-6. Столбики ошибок представляют собой среднее +/- стандартное отклонение минимум трех биологических повторов. ND = не определено (ниже порога обнаружения). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 (t-критерий Стьюдента).

  Связывание IL-6 с рецепторными комплексами, содержащими gp130, необходимо для фосфорилирования STAT3 и ядерной транслокации в клетках рака шейки матки

  Передача сигналов IL-6 инициируется взаимодействием между IL-6 и рецептором IL-6 (IL-6R) — корецепторный комплекс gp130 [17].В клетках рака шейки матки блокирующие антитела против IL-6 и gp130 были использованы для подтверждения того, что они необходимы для фосфорилирования STAT3. Во-первых, мы подтвердили, что IL-6 был медиатором фосфорилирования STAT3, секретируемого HPV + клетками, путем предварительной инкубации клеток C33A с блокирующим gp130 антителом перед обработкой их HeLa или CaSKi-CM. Отдельно мы добавляли нейтрализующее антитело к IL-6 в CM перед добавлением в клетки. CM из HPV + клеток индуцировал фосфорилирование STAT3 в HPV- клетках; однако предварительная инкубация клеток C33A с антителом, блокирующим gp130, или добавление CM, содержащего нейтрализующее антитело к IL-6, блокировало способность среды, кондиционированной HPV +, индуцировать фосфорилирование STAT3 (фиг. 4A) и ядерную транслокацию (фиг. 4B).Это предполагает, что секреция IL-6 из клеток рака шейки матки HPV + способна индуцировать паракринную активацию STAT3 в клетках рака шейки матки HPV посредством передачи сигналов IL-6 / gp130.

  Рисунок 4. Передача сигналов IL-6 / gp130 необходима для фосфорилирования STAT3 и ядерной транслокации в клетках рака шейки матки.

  A) Репрезентативный вестерн-блоттинг клеток C33A, обработанных кондиционированной средой (CM) из клеток HeLa и CaSKi в течение 2 часов. Клетки предварительно обрабатывали антителами IgG, анти-IL6 или анти-gp130 в течение 4 часов перед добавлением CM. Клеточные лизаты анализировали на фосфорилированную и общую экспрессию STAT3. GAPDH служил контролем загрузки. Данные представляют не менее трех биологических независимых повторов. B) клеток C33A, обработанных кондиционированной средой (CM) из клеток HeLa и CaSKi в течение 2 часов. Клетки предварительно обрабатывали антителами IgG, анти-IL6 или анти-gp130 в течение 4 часов перед добавлением CM. Затем клетки анализировали иммунофлуоресцентным окрашиванием на общий STAT3 (зеленый) и контрастировали с DAPI, чтобы выделить ядра (синий на объединенных панелях).Масштабная линейка 20 мкм. C) Клетки HeLa обрабатывали IgG, анти-IL6 или анти-gp130 в течение 4 часов. Клеточные лизаты анализировали на фосфорилированную и общую экспрессию STAT3. GAPDH служил контролем загрузки. Данные представляют не менее трех биологических независимых повторов. D) Клетки HeLa обрабатывали IgG, анти-IL6 или анти-gp130 в течение 4 часов. Затем клетки анализировали иммунофлуоресцентным окрашиванием на общий STAT3 (зеленый) и контрастировали с DAPI, чтобы выделить ядра (синий на объединенных панелях). Масштабная линейка 20 мкм.

  Наконец, чтобы подтвердить, что передача сигнала IL-6 / gp130 необходима для аутокринной активации STAT3 в клетках рака шейки матки HPV +, клетки HeLa предварительно инкубировали с нейтрализующими антителами IL-6 и g130. Инкубация с любым нейтрализующим антителом привела к снижению фосфорилирования STAT3 на обоих сайтах фосфорилирования, что сопровождалось блокировкой ядерной транслокации STAT3, предполагая, что IL-6 необходим для аутокринной активации STAT3 (рис. 4C и D). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что ВПЧ индуцирует аутокринную и паракринную передачу сигналов IL-6 / STAT3 при раке шейки матки.

  HPV E6 индукция экспрессии IL-6 необходима для фосфорилирования STAT3

  Повышенное фосфорилирование STAT3, наблюдаемое в кератиноцитах, содержащих HPV, зависит от онкопротеина E6 [19]. Кроме того, ранее было продемонстрировано, что Е6 HPV16 индуцирует секрецию IL-6 в клетках немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) [24]. Таким образом, была оценена способность E6 индуцировать экспрессию IL-6 в клетках рака шейки матки. С этой целью мы сначала трансфицировали C33A с помощью репортера люциферазы промотора IL-6 в комбинации с плазмидой экспрессии GFP-E6 или вектором GFP.Экспрессия Е6 HPV18 значительно увеличивала активность промотора IL-6 примерно в 4 раза по сравнению с контролем GFP (фиг. 5A; p = 0,002). Это соответствовало ~ 4-кратному увеличению экспрессии эндогенной мРНК IL-6 (фиг. 5B; p = 0,01) и экспрессии белка IL-6 (фиг. 5C). Наконец, экспрессия E6 привела к значительному увеличению секреции IL-6 (фиг. 5D; p = 0,0245). Чтобы продемонстрировать, что эндогенный E6 может индуцировать экспрессию IL-6 в HPV + клетках, клетки HeLa (рис. 5) или CaSKi (дополнительный рис. 1) обрабатывали двумя siRNA, специфичными для E6.Нокдаун экспрессии E6 привел к значительному снижению экспрессии мРНК IL-6, (рис. 5E; p = 0,046 и дополнительный рис. 1A), экспрессии белка IL-6 (рис. 5F и дополнительный рис. 1B) и секреции (рис. 5G; p = 0,003 и дополнительный рисунок 1C). Вместе эти данные демонстрируют, что HPV E6 увеличивает экспрессию и секрецию IL-6.

  Рис. 5. Экспрессия IL-6, индуцированная HPV E6, необходима для фосфорилирования STAT3.

  A) Репрезентативный анализ репортера люциферазы из клеток C33A, котрансфицированных GFP-меченным E6 и репортерным промотором IL-6.Активность промотора измеряли с использованием двойной люциферазной системы. Данные представлены относительно контроля, трансфицированного GFP. B) Клетки C33A временно трансфицировали GFP или GFP-меченым HPV18 E6, и РНК экстрагировали для анализа экспрессии IL-6 с помощью qRT-PCR. Образцы были нормализованы по уровням мРНК U6. Репрезентативные данные представлены относительно контроля GFP. C) Репрезентативный вестерн-блот клеток C33A, временно трансфицированных GFP или GFP-меченым HPV18 E6 и проанализированных на экспрессию IL-6.Экспрессию HPV E6 подтверждали с использованием антитела GFP, и GAPDH служил в качестве контроля загрузки. D) Клетки C33A временно трансфицировали GFP или GFP-меченым HPV18 E6. Культуральную среду анализировали на белок IL-6 с помощью ELISA. E) Клетки HeLa трансфицировали пулом двух специфических миРНК против HPV18 E6 и анализировали на экспрессию мРНК IL-6 с помощью qRT-PCR. Образцы были нормализованы по уровням мРНК U6. F) Репрезентативный вестерн-блот клеток HeLa, трансфицированных пулом двух специфических миРНК против Е6 HPV18 и проанализированных на экспрессию IL-6.Нокдаун Е6 ВПЧ18 подтверждали с использованием антитела против Е6 и р53 ВПЧ. GAPDH служил контролем загрузки. G) Клетки HeLa трансфицировали пулом двух специфических миРНК против Е6 HPV18. Культуральную среду анализировали на белок IL-6 с помощью ELISA. H) Типичный вестерн-блоттинг клеток C33A, временно трансфицированных GFP или GFP-меченых HPV18 E6 и обработанных IgG, анти-IL6 или анти-gp130 в течение 4 часов до сбора урожая. Затем клеточные лизаты анализировали на фосфорилированный и общий STAT3.Экспрессию HPV E6 подтверждали с использованием антитела GFP, и GAPDH служил в качестве контроля загрузки. Столбцы представляют собой средние значения ± стандартное отклонение по крайней мере для трех независимых биологических повторов. * P <0,05, ** P <0,01 (t-критерий Стьюдента).

  Чтобы подтвердить, была ли экспрессия IL-6 необходима для E6-опосредованного фосфорилирования STAT3, E6 HPV18 экспрессировали в клетках C33A, которые затем обрабатывали нейтрализующими антителами против IL-6 или корецептора gp130. Как мы показали ранее, экспрессия HPV E6 индуцировала фосфорилирование STAT3 как по остаткам Y705, так и по S727 в клетках C33A [19].Обработка экспрессирующих E6 клеток нейтрализующими антителами против IL-6 или gp130 приводила к потере фосфорилирования STAT3 (фиг. 5H). Это предполагает, что E6-опосредованная индукция экспрессии IL-6 необходима для аутокринного фосфорилирования STAT3 в клетках рака шейки матки + HPV.

  HPV E6 активирует NFκB для индукции экспрессии IL-6

  Несколько сигнальных путей могут индуцировать экспрессию IL-6, включая фактор транскрипции NFκB, который активируется в ответ на ряд внеклеточных лигандов, таких как TNFα [25]. Ранее было показано, что HPV E6 активирует передачу сигналов NFκB в условиях гипоксии [26, 27]. Чтобы оценить, необходим ли NFκB для повышенной экспрессии IL-6, мы сначала проверили, будет ли экспрессия E6 изолированно активировать NFκB в клетках C33A. При использовании репортерной плазмиды люциферазы, управляемой NFκB, сверхэкспрессия E6 индуцировала активность NFκB примерно в 3 раза по сравнению с контролем GFP (фиг. 6A; p = 0,001).

  Рисунок 6. Экспрессия IL-6, опосредованная HPV E6, требует активности NF-κB.

  A) Репрезентативный анализ люциферазного репортера из клеток C33A, котрансфицированных GFP-меченным E6, и репортером ConA, содержащим тандемные сайты связывания κB.Активность промотора измеряли с использованием двойной люциферазной системы. Данные представлены относительно контроля, трансфицированного GFP. B) Типичный вестерн-блоттинг клеток C33A, временно трансфицированных GFP или GFP-меченых HPV18 E6 и проанализированных на фосфорилированную и общую экспрессию p65. Экспрессию HPV E6 подтверждали с использованием антитела GFP, и GAPDH служил в качестве контроля загрузки. C) Репрезентативный вестерн-блот клеток HeLa, трансфицированных пулом двух специфических siRNA против Е6 HPV18 и проанализированных на экспрессию фосфорилированного и общего p65.Нокдаун Е6 ВПЧ18 подтверждали с использованием антитела против Е6 и р53 ВПЧ. GAPDH служил контролем загрузки. D-F) Клетки C33A котрансфицировали GFP, GFP-меченый HPV18 E6 или GFP-меченый HPV18 E6 и мутант IκBα (IκBm). Затем клетки либо оставляли необработанными, либо обрабатывали ингибитором IKK VII (IKKi). D) Общую РНК экстрагировали для анализа экспрессии IL-6 с помощью qRT-PCR. Образцы были нормализованы по уровням мРНК U6. Репрезентативные данные представлены относительно контроля GFP. E) Лизаты клеток анализировали на экспрессию фосфорилированных и общих p65 и IL-6. Экспрессию HPV E6 подтверждали с использованием антитела GFP, и GAPDH служил в качестве контроля загрузки. F) Культуральную среду анализировали на белок IL-6 с помощью ELISA. G-I) Клетки HeLa, трансфицированные пулом двух специфических миРНК против Е6 HPV18. G) Тотальную РНК экстрагировали для анализа экспрессии IL-6 методом qRT-PCR. Образцы были нормализованы по уровням мРНК U6.Репрезентативные данные представлены относительно контроля GFP. H) Лизаты клеток анализировали на экспрессию фосфорилированных и общих p65 и IL-6. Экспрессию HPV E6 подтверждали с использованием антитела GFP, и GAPDH служил в качестве контроля загрузки. I) Культуральную среду анализировали на белок IL-6 с помощью ELISA. Столбцы представляют собой средние значения ± стандартное отклонение по крайней мере для трех независимых биологических повторов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 (t-критерий Стьюдента).

  Каноническая передача сигналов NFκB приводит к фосфорилированию субъединицы p65 и ее ядерной транслокации, где она транскрипционно активна в комплексе с дополнительными субъединицами NFκB, включая p50 [25]. Избыточная экспрессия E6 в клетках C33A индуцировала устойчивое фосфорилирование p65, не влияя на общий уровень белка p65 (рис. 6B). Напротив, нокдаун siRNA E6 в клетках HeLa снижает фосфорилирование p65 (рис. 6C), что в совокупности предполагает, что E6 HPV активирует передачу сигналов NFκB.

  Чтобы оценить, требуется ли активность NFκB для увеличения продукции IL-6, наблюдаемого в клетках, экспрессирующих E6, мы использовали двойной подход для предотвращения активации NFκB в клетках C33A, сверхэкспрессирующих E6. Клетки обрабатывали либо низкомолекулярным ингибитором (IKKi), нацеленным на комплекс IKKα / β, который необходим для фосфорилирования и активации NFκB, либо трансфицировали плазмидой, кодирующей мутантный белок IκBα (IκBm), который не может расщепляться и как таковой сохраняет NFκB. в цитозоле в неактивной форме [28].Экспрессия E6 увеличивала продукцию мРНК IL-6 , а ингибирование NFκB с использованием IKKi или IκBm приводило к значительному снижению экспрессии мРНК IL-6 (рис. 6D; IKKi, p = 0,00001; IκBm, p = 0,04). , Уровни белка IL-6 (фиг. 6E) и секреция (фиг. 6F; IKKi, p = 0,02; IκBm, p = 0,007). Важно отметить, что обе стратегии эффективно ингибируют активность NFκB, о чем можно судить по снижению фосфорилирования p65 (рис. 6E).

  Чтобы подтвердить, была ли активность NFκB также необходима для опосредования повышенных уровней IL-6, наблюдаемых в HPV + раковых клетках, активность NFκB была заблокирована в клетках HeLa.Ингибирование NFκB привело к снижению экспрессии мРНК IL-6, (рис. 6F; IKKi, p = 0,03; IκBm, p = 0,02), уровней белка IL-6 (рис. 6H) и секреции (рис. 6I; IKKi, p = 0,007; IκBm, p = 0,007). В совокупности эти данные демонстрируют, что экспрессия IL-6, опосредованная HPV E6, зависит от активности NFκB.

  NFκB необходим для фосфорилирования STAT3 в клетках, экспрессирующих E6.

  Поскольку NFκB требовался для увеличения экспрессии IL-6, наблюдаемого в линиях раковых клеток HPV +, было необходимо проверить, требуется ли NFκB также для активации STAT3. Сначала мы протестировали способность индуктора активации NFκB, TNFα, индуцировать фосфорилирование STAT3. Обработка клеток C33A, лишенных сыворотки, с помощью TNFα увеличивала фосфорилирование p65, которое достигало пика через 0,5 часа после обработки (фиг. 7A; дорожка 3). Обработка TNFα также индуцировала экспрессию IL-6; через 0,5 часа после лечения и оставался высоким до 24 часов после лечения. Обработка TNFα также приводила к увеличению фосфорилирования STAT3 как по остаткам Y705, так и по S727; однако это достигло пика позже, через 2 часа (рис. 7A; дорожка 5).TNFα-зависимая ядерная транслокация STAT также может наблюдаться через 2 часа после обработки (фиг. 7B).

  Рис. 7. Активность NF-κB необходима для передачи сигналов STAT3, опосредованной HPV E6.

  A) Репрезентативный вестерн-блоттинг клеток C33A, обработанных 20 нг / мл рекомбинантного человеческого TNFα в указанные моменты времени. Лизаты клеток анализировали на фосфорилированный и общий p65, фосфорилированный и общую экспрессию STAT3 и IL-6. GAPDH служил контролем загрузки. Данные представляют не менее трех биологических независимых повторов. B) Клетки C33A, обработанные 20 нг / мл рекомбинантного человеческого TNFα в течение 60 минут, фиксировали и анализировали иммунофлуоресцентным окрашиванием на общий STAT3 (зеленый) и общий p65 (красный) и контрастировали с DAPI, чтобы выделить ядра (синий на объединенные панели). Масштабная линейка 20 мкм. C) Клетки C33A котрансфицировали GFP, GFP-меченый HPV18 E6 или GFP-меченый HPV18 E6 и мутант IκBα (IκBm). Затем клетки либо оставляли необработанными, либо обрабатывали ингибитором IKK VII (IKKi). Затем клеточные лизаты анализировали на фосфорилированный и общий p65, фосфорилированный и общую экспрессию STAT3.Экспрессию HPV E6 подтверждали с использованием антитела GFP, и GAPDH служил в качестве контроля загрузки. D) Репрезентативный вестерн-блоттинг клеток HeLa, обработанных возрастающими дозами ингибитора IKKα / β Ингибитор VIIKK (IKKi). Лизаты клеток анализировали на экспрессию фосфорилированного и общего p65, фосфорилированного и общую экспрессию STAT3 и IL-6. GAPDH служил контролем загрузки. E) Репрезентативный вестерн-блоттинг клеток HeLa, трансфицированных мутантом IκBα (IκBm). Лизаты клеток анализировали, как в D).F) клеток C33A не содержали сыворотки в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали кондиционирующей средой HeLa из клеток HeLa, обработанных DMSO или IKKi или трансфицированных pcDNA или IκBm. Клеточные лизаты анализировали на фосфорилированную и общую экспрессию STAT3. GAPDH служил контролем загрузки. G) Клетки C33A голодали по сыворотке в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали кондиционирующей средой HeLa из клеток HeLa, обработанных DMSO или IKKi или трансфицированных pcDNA или IκBm. Клетки анализировали иммунофлуоресцентным окрашиванием на общий STAT3 (зеленый) и контрастировали с DAPI для выделения ядер (синий на объединенных панелях).Масштабная линейка 20 мкм.

  Чтобы оценить важность активации NFκB для фосфорилирования STAT3, HPV E6 был сначала сверхэкспрессирован в клетках C33A с или без обработки ингибитором NFκB IKKi или коэкспрессией IκBm. Сверхэкспрессия E6 заметно увеличивала фосфорилирование p65 и STAT3, а ингибирование NFκB при использовании любого подхода приводило к потере фосфорилирования STAT3 (рис. 7C). Кроме того, блокада NFκB также приводила к снижению фосфорилирования STAT3 в клетках HeLa (рис. 7D и E). предполагая, что E6-опосредованное фосфорилирование STAT3 зависит от активности NFκB.Наконец, чтобы убедиться, что NFκB важен для паракринной активации STAT3 в клетках C33A, мы взяли кондиционированную среду из клеток HeLa, в которых подавлялся NFκB, и добавили ее к клеткам C33A. Эта кондиционированная среда не индуцирует фосфорилирование STAT3 (фиг. 7F) и ядерную транслокацию (фиг. 7G). Важно отметить, что ингибирование активности NFκB не имело эффекта на фосфорилирование STAT3 или ядерную транслокацию, опосредованную обработкой экзогенным IL-6 (Supp Fig 2A и 2B), демонстрируя, что NFκB находится выше секреции IL-6.Вместе эти данные предполагают, что NFκB необходим для аутокринной и паракринной активации STAT3.

  Протеинкиназа Akt способствует активации NFκB и продукции IL-6 в клетках, экспрессирующих E6.

  NFκB активируется множеством вышестоящих сигнальных компонентов в зависимости от стимула и ткани [29]. Сигнальный путь PI3K / Akt часто активируется при раке шейки матки из-за мутаций в гене PIK3CA [30], а Akt может активировать NFκB при некоторых формах рака [31, 32].Кроме того, Akt является известным медиатором экспрессии IL-6 [33]. Поэтому мы оценили, участвует ли Akt в активации NFκB и секреции IL-6 при раке шейки матки + ВПЧ. Во-первых, мы подтвердили, что E6 может активировать Akt, что измеряется по увеличению фосфорилирования Akt, как было показано ранее [34]. Избыточная экспрессия E6 в клетках C33A приводила к заметному увеличению фосфорилирования Akt как по треонину 308, так и по серину 473, не влияя на общие уровни белка Akt (фиг. 8A). Кроме того, нокдаун siRNA E6 в клетках HeLa снижает фосфорилирование Akt (фиг. 8B), что вместе подтверждает, что E6 HPV активирует Akt.

  Рисунок 8. Активация Akt с помощью HPV E6 способствует экспрессии IL-6 через NF-κB.

  A) Репрезентативный вестерн-блоттинг клеток C33A, временно трансфицированных GFP или GFP-меченым HPV18 E6 и проанализированных на фосфорилированную и общую экспрессию Akt. Экспрессию HPV E6 подтверждали с использованием антитела GFP, и GAPDH служил в качестве контроля загрузки. B) Репрезентативный вестерн-блот клеток HeLa, трансфицированных пулом двух специфических миРНК против Е6 HPV18 и проанализированных на экспрессию фосфорилированных и общих Akt.Нокдаун Е6 ВПЧ18 подтверждали с использованием антитела против Е6 и р53 ВПЧ. GAPDH служил контролем загрузки. C-E) Клетки C33A котрансфицировали GFP, GFP-меченый HPV18 E6 или GFP-меченый HPV18 E6 и мутант Akt (Akt-DN). Затем клетки либо оставляли необработанными, либо обрабатывали ингибитором Akt VIII (Akti). C) Тотальную РНК экстрагировали для анализа экспрессии IL-6 с помощью qRT-PCR. Образцы были нормализованы по уровням мРНК U6. Репрезентативные данные представлены относительно контроля GFP. D) Лизаты клеток анализировали на экспрессию фосфорилированных и общих p65 и IL-6. Экспрессию HPV E6 подтверждали с использованием антитела GFP, и GAPDH служил в качестве контроля загрузки. E) Культуральную среду анализировали на белок IL-6 с помощью ELISA. F-H) Клетки HeLa и CaSki, трансфицированные Akt-DN или обработанные Akti. F) Полную РНК экстрагировали для анализа экспрессии IL-6 с помощью qRT-PCR. Образцы были нормализованы по уровням мРНК U6. Репрезентативные данные представлены относительно контроля GFP. G) Лизаты клеток анализировали на экспрессию фосфорилированных и общих p65 и IL-6. Экспрессию HPV E6 подтверждали с использованием антитела GFP, и GAPDH служил в качестве контроля загрузки. H) Культуральную среду анализировали на белок IL-6 с помощью ELISA. Столбцы представляют собой средние значения ± стандартное отклонение по крайней мере для трех независимых биологических повторов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 (t-критерий Стьюдента).

  Для выяснения вклада активации Akt в продукцию IL-6, наблюдаемого в клетках, экспрессирующих E6, клетки обрабатывали либо мощным аллостерическим ингибитором Akt (Akti), нацеленным на изоформы Akt1 и 2 [35], либо трансфицировали плазмидой, кодирующей каталитически неактивный мутант Akt (Akt-DN) [36].Ингибирование Akt любым из подходов привело к значительному снижению экспрессии мРНК IL-6 (фиг. 8C; Akti, p = 0,004; Akt-DN, p = 0,04 и секреция (фиг. 8E; Akti, p = 0,05; Akt-DN). , p = 0,02).

  Для подтверждения того, что Akt-опосредованное увеличение IL-6 трансдуцировалось через NFκB, мы измерили уровни фосфорилирования p65 в экспрессии клеток C33A HPV E6, обработанных либо Akti, либо котрансфицированных Akt-DN. наблюдали потерю фосфорилирования Akt, указывая на то, что стратегия ингибирования была успешной, и это было связано со снижением экспрессии белка IL-6 (рис. 8D) и частичным снижением фосфорилирования p65, предполагая, что Akt может действовать выше NFκB в регуляция IL-6.

  Мы также подтвердили влияние ингибирования Akt на продукцию IL-6 как в клетках HeLa, так и в клетках HPV16 + CaSKi. В отличие от клеток HeLa, которые имеют PIK3CA дикого типа, клетки CaSKi экспрессируют мутант E545K PIK3CA , что приводит к конститутивной активации передачи сигналов PI3K / Akt [37]. Интересно, что ингибирование Akt в клетках CaSKi имело больший эффект в отношении снижения экспрессии мРНК IL-6 и (фиг. 8F), уровней белка IL-6 (фиг. 8G) и секреции (фиг. 8H), чем в клетках HeLa.Кроме того, ингибирование Akt привело к большему снижению фосфорилирования p65 в клетках CaSKi. Эти данные подтверждают, что передача сигналов Akt вносит вклад в продукцию IL-6 в клетках рака шейки матки HPV посредством регуляции NFκB.

  Экспрессия IL-6 коррелирует с прогрессированием заболевания шейки матки

  Ось передачи сигналов IL-6 / STAT3 нарушена при некоторых видах рака [17]. Кроме того, IL-6 чрезмерно экспрессируется при раке легких и раке головы и шеи [38, 39]. Поэтому мы проанализировали образцы цитологического материала шейки матки от группы пациентов с ВПЧ16 +, представляющие прогрессирование развития заболевания (CIN1-CIN3) и нормальную ткань шейки матки, отрицательную по ВПЧ, чтобы изучить ее роль в заболевании шейки матки.Повышенные уровни мРНК IL-6 достоверно коррелировали с прогрессированием заболевания через CIN1-CIN3 (рис. 9A; CIN1, p = 0,01; CIN2, p = 0,004; CIN3, p = 0,00005), причем наибольшее увеличение наблюдалось в образцах CIN3, когда по сравнению с нормальной тканью шейки матки. Кроме того, уровни белка IL-6 также коррелировали с прогрессированием заболевания (рис. 9B и C; CIN1, p = NS; CIN2, p = 0,0003; CIN3, p = 0,04), снова показывая наибольшее увеличение CIN3. Наконец, изучая доступную базу данных микрочипов нормальных образцов шейки матки в сравнении с образцами рака шейки матки, мы наблюдали статистически значимое увеличение экспрессии мРНК IL-6 в образцах рака шейки матки (рис.9D; p = 0.03). Вместе эти данные демонстрируют, что экспрессия IL-6 повышена при заболеваниях шейки матки, связанных с ВПЧ, и при раке шейки матки, связанном с ВПЧ.

  Рисунок 9. Экспрессия IL-6 коррелирует с прогрессированием заболевания шейки матки и активируется при раке шейки матки.

  A) Точечный график анализа qRT-PCR для РНК, выделенной из панели цитологических образцов поражений CIN возрастающей степени. Были проанализированы пять образцов каждой клинической степени (отрицательный, CIN I-III), и уровни мРНК были нормализованы к отрицательным образцам.Образцы были нормализованы по уровням мРНК U6. Репрезентативные данные представлены относительно клеток рака шейки матки HPV. Столбцы — это средние значения ± стандартное отклонение минимум трех биологических повторов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 (t-критерий Стьюдента). B) Репрезентативные вестерн-блоты цитологических образцов поражений CIN возрастающей степени проанализировали экспрессию IL-6. GAPDH служил контролем загрузки. C) Точечная диаграмма денситометрического анализа панели цитологических образцов.Двадцать образцов каждой клинической степени (негативный, CIN I-III) были проанализированы с помощью вестерн-блоттинга, а денситометрический анализ был выполнен с использованием ImageJ. GAPDH использовался в качестве контроля загрузки. D) Точечный график данных, полученных из набора данных GSE9750 в базе данных GEO. Были нанесены произвольные значения экспрессии мРНК IL-6 в образцах нормальной шейки матки (n = 23) и рака шейки матки (n = 28). Столбики ошибок представляют собой среднее +/- стандартное отклонение минимум трех биологических повторов. * Р <0.05, ** P <0,01, *** P <0,001 (t-критерий Стьюдента).

  Фигура 10. E6 активирует опосредованный NFκB путь STAT3 при раке шейки матки + ВПЧ.

  Схематическая диаграмма E6-опосредованной передачи сигналов STAT3 в клетках рака шейки матки HPV +.

  Обсуждение

  Некоторые онкогенные вирусы активируют STAT3, чтобы управлять клеточной пролиферацией, вирусной репликацией и онкогенезом [18]. Используя модель первичной клеточной культуры, мы ранее показали, что E6 активирует сигнальный путь STAT3 в первичных кератиноцитах во время жизненного цикла HPV [19].Кроме того, мы показали, что активация и экспрессия STAT3 коррелируют с прогрессированием заболевания шейки матки. Хотя мы продемонстрировали, что киназы JAK2 и MAP ответственны за фосфорилирование STAT3 в клетках, содержащих HPV, факторы хозяина, кооптированные HPV E6, необходимые для управления этими событиями, плохо изучены. Более того, учитывая, что предыдущая работа продемонстрировала, что ингибирование STAT3 вредно для выживания раковых клеток HPV [20, 21], было необходимо получить более полное понимание путей хозяина, необходимых для активации STAT3.

  Онкогенные вирусы часто увеличивают продукцию провоспалительных цитокинов как консервативный механизм усиления передачи сигналов STAT3. В частности, IL-6 сверхэкспрессируется при различных формах рака и коррелирует с повышенной активностью STAT3 [17]. IL-6 проявляет множество плейотропных функций, будучи как провоспалительным, так и иммунодепрессивным, взаимодействуя с окружающей стромой опухоли [40]. При HNSCC и плоскоклеточном раке полости рта уровни IL-6 в сыворотке значительно выше, чем у пациентов контрольной группы, и сывороточный IL-6 является потенциальным биомаркером этих видов рака [41].Кроме того, нацеливание на IL-6 в сочетании с ингибиторами EGFR, такими как цитуксимаб, в настоящее время исследуется в качестве потенциальной терапии HNSCC из-за устойчивости к ингибированию EGFR, наблюдаемой во многих опухолях [42, 43].

  Экспрессия IL-6 может регулироваться фактором транскрипции NFκB. В канонической передаче сигналов NFκB различные стимулы, такие как провоспалительные цитокины, включая фактор некроза опухоли α (TNFα), инициируют сигнальный каскад, приводящий к фосфорилированию IκBα, отрицательного регулятора пути NFκB, с помощью киназ IκB (IKKs).Это приводит к протеасомной деградации IκBα и ядерной транслокации компонентов NFκB p65 и p50 [25].

  Саркома Капоши, связанный с вирусом герпеса (KSHV), подавляет IκBα через вирусную miRNA miR-K12-1, что приводит к усилению экспрессии IL-6 и активации STAT3 [44]. И сердцевинный белок вируса гепатита C (HCV), и белок US28 цитомегаловируса человека (HCMV) индуцируют фосфорилирование STAT3 и ядерную транслокацию аутокринным способом за счет повышения регуляции IL-6 [45, 46]

  пролиферация опухолей за счет индукции зависимого от фактора роста сосудистого эпителия (VEGF) ангиогенеза в зависимости от STAT3 [47] и также была предложена в качестве потенциального биомаркера [48].Было показано, что онкобелок HPV E6 необходим для экспрессии и секреции клеток IL-6 NSCLC [24]; однако роль E6 в управлении экспрессией IL-6 при раке шейки матки неясна. Кроме того, вклад IL-6 в активацию STAT3 при раке шейки матки плохо определен. Наши данные показывают, что повышенное фосфорилирование STAT3 в клетках рака шейки матки HPV + было связано с увеличением экспрессии IL-6 под действием HPV E6 и индукцией аутокринной / паракринной передачи сигналов IL-6 / gp130 / STAT3.В клетках рака шейки матки передача сигналов EGFR может индуцировать активацию STAT3 [49]; однако данные здесь идентифицировали, что блокада передачи сигналов IL-6 или gp130 с использованием нейтрализующих антител отменяет фосфорилирование STAT3, предполагая, что IL-6 / gp130 является основным детерминантом фосфорилирования STAT3 в клетках рака шейки матки HPV +. Мы определили NFκB как важный вышестоящий медиатор экспрессии IL-6. NFκB является ключевым компонентом воспалительной реакции, которая является ключевым признаком рака [50]. Индуцирование воспаления с помощью различных механизмов вызывает около 20% случаев рака, включая роль воспалительного заболевания кишечника в развитии колоректального рака (CRC) [51].Важно отметить, что инфекция также играет важную роль в развитии рака, вызванного воспалением; H. pylori может вызывать рак желудка, в то время как инфицирование вирусами гепатита С может приводить к развитию гепатоцеллюлярной карциномы [52-54]. Предыдущие данные предполагают, что воспаление, вызванное инфекцией ВПЧ, может способствовать развитию рака шейки матки, вызванного ВПЧ [55, 56]. В самом деле, несколько генов, которые, как известно, индуцируются воспалительным ответом, включая ЦОГ-2 [57], активируются при раке шейки матки.

  Роль в NF-kB карцином шейки матки остается спорным, с ВПЧ участвует как в активации и ингибирования фактора транскрипции [26, 58, 59]. Было продемонстрировано, что HPV E6 увеличивает экспрессию компонентов NFκB и индуцирует активность связывания ДНК NFκB, увеличивая экспрессию провоспалительных цитокинов [60]. Кроме того, E6 снижает экспрессию деубиквитиназы CYLD, известного негативного регулятора передачи сигналов NFκB, в гипоксических клетках [27]. Напротив, E6, как было показано, ингибирует транскрипционную активность NFκB, тогда как HPV E7 может ослаблять ядерную транслокацию p65 [61].Представленные здесь данные демонстрируют, что Е6 HPV18 увеличивает фосфорилирование p65, необходимое для ядерной транслокации и трансактивационной способности p65. Кроме того, мы демонстрируем, что NFκB необходим для экспрессии IL-6 в клетках рака шейки матки HPV +.

  Чтобы получить представление о механизме регуляции продукции IL-6 в клетках рака шейки матки HPV +, мы сосредоточились на сигнальных путях, ведущих к активации NFκB. Протеинкиназа Akt может регулировать активацию NFκB при определенных обстоятельствах.В PTEN-нулевых клетках Akt активирует NFκB посредством связывания нижележащих компонентов mTOR и Raptor с комплексом IKK, стимулируя активацию NFκB [62]. Кроме того, Akt может непосредственно фосфорилировать и активировать IKKα на Т23, чтобы усилить фосфорилирование p65 [63]. Наши данные демонстрируют, что Akt способствует фосфорилированию p65 и экспрессии IL-6 при раке шейки матки HPV +; однако ингибирование Akt только частично снижает экспрессию IL-6, предполагая, что альтернативные компоненты, расположенные выше, могут быть вовлечены в опосредованную NFκB экспрессию IL-6.

  При раке шейки матки ген PIK3CA подвергается обширной мутации, причем наиболее частая мутация (E545K) приводит к конститутивной передаче сигналов PI3K / Akt [64]. Эта онкогенная мутация может активировать передачу сигналов IKK / NFκB и увеличивать секрецию IL-6 и паракринную активацию STAT3 в эпителиальных клетках [65]. Поэтому мы сравнили эффект ингибирования Akt на продукцию IL-6 в двух линиях клеток рака шейки матки — одной с PIK3CA дикого типа (HeLa) и другой с мутантом E545K (CaSKi).Мы демонстрируем, что в клетках, экспрессирующих мутацию E545K и, таким образом, имеющих конститутивную передачу сигналов PI3K / Akt, ингибирование Akt имеет больший вклад в ось передачи сигналов NFκB / IL-6, чем в клетках, экспрессирующих PIK3CA дикого типа. Это говорит о том, что нацеливание на путь PI3K / Akt при раке шейки матки, который содержит активирующие мутации PIK3CA , такие как E545K, может иметь терапевтический эффект из-за ингибирования передачи сигналов NFκB / IL-6 и паракринной активации STAT3. Действительно, недавно было продемонстрировано, что мутант PIK3CA E545K придает устойчивость к цисплатину, предполагая, что комбинированное лечение цисплатином и ингибитором PI3K может иметь синергетические эффекты при раке шейки матки [66].

  Данные, представленные здесь, демонстрируют, что NFκB необходим для индукции IL-6 и аутокринной / паракринной индукции фосфорилирования STAT3 в клетках рака шейки матки HPV +. Кроме того, мы идентифицируем, что протеинкиназа Akt находится выше передачи сигналов NFκB / IL-6 в качестве дифференциального регулятора в зависимости от клеточного контекста из-за активации мутаций PIK3CA . Это может позволить разделить подгруппу рака шейки матки, для которой может быть полезно комбинированное лечение ингибитором PI3K, таким как пан-PI3K ингибитор бупарлисиб (BKM120) или PI3Kα-селективный ингибитор альпелисиб (BYL719) [67], с стандартные методы лечения, такие как цисплатин.

  Методы и материалы

  Культура клеток

  C33A (ВПЧ-отрицательная карцинома шейки матки), DoTc2 4510 (ВПЧ-отрицательная карцинома шейки матки), SiHa (ВПЧ-16-положительная плоскоклеточная карцинома шейки матки), CaSKi (ВПЧ 16-положительная плоскоклеточная карцинома шейки матки), SW756 Клетки плоской карциномы, положительные по HPV 18) и HeLa (положительные по HPV 18, эпителиальная аденокарцинома шейки матки) были приобретены в ATCC и выращены в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (ThermoFischer Scientific, США) и 50 ед. / мл пенициллин / стрептомицин (Lonza).

  Ингибиторы и цитокины

  Ингибитор IKKα / β Ингибитор IKK VII был приобретен у Calbiochem и использован в конечной концентрации 5 мкМ, если не указано иное. Ингибитор Akt1 / 2 Akt VIII был приобретен у Calbiochem и использован в конечной концентрации 5 мкМ, если не указано иное. Рекомбинантный человеческий IL-6 был приобретен в R&D Systems и использован в конечной концентрации 20 нг / мл, если не указано иное. Рекомбинантный TNFα был приобретен у PeproTech EC Ltd и использовался в конечной концентрации 10 нг / мл.Все соединения использовали в концентрациях, требуемых для минимизации потенциальной активности не по назначению. Нейтрализующее антитело к IL-6 (ab6628) было приобретено у Abcam и использовано в конечном разведении 11: 400. Нейтрализующее антитело gp130 (MAB228) было приобретено в R&D Systems и использовано в конечной концентрации 1 мкг / мл.

  Плазмиды и миРНК

  Плазмиды, экспрессирующие последовательности Е6 HPV18, амплифицировали из генома HPV18 и клонировали в peGFP-C1 с помощью рестрикционных ферментов SalI и XmaI .Плазмида, управляющая люциферазой Firefly от промотора IL-6, была любезным подарком профессора Дерека Манна (Университет Ньюкасла) и использовалась, как описано ранее [68]; промотор ConA (содержащий тандемные ответные элементы NFκB) [69] и конститутивный репортер люциферазы Renilla (pRLTK) были описаны ранее [68]. pLNCX1 HA AKT1 были приобретены у Addgene (Кембридж, Массачусетс, США), и мы благодарим главных исследователей Джима Дарнелла, Дэвида Балтимора, Линчжао Ченга и Доменчино Акчили за их хранение.Мутант IκBα S33 / 36A был любезным подарком профессора Рональда Хэя (Университет Данди). Для экспериментов с миРНК две последовательности миРНК, специфически нацеленные на Е6 HPV18, были приобретены у GE Healthcare со следующими последовательностями: 5’CUAACACUGGGUUAUACAA’3 и 5’CTAACTAACACTGGGTTAT’3. Для HPV16 единственная миРНК, нацеленная на белок E6 HPV16, была приобретена у Santa Cruz Biotechnology (SCBT; sc-156008). Для каждого эксперимента использовали 40 нМ объединенной миРНК, и клеточные лизаты собирали через 72 часа.

  Трансфекция и лизис клеток млекопитающих

  Временные трансфекции проводили с соотношением ДНК к липофектамину ^® 2000 (ThermoFischer) 1: 2.5. Через 48 часов после трансфекции клетки лизировали в буфере для лизиса Лидса для вестерн-блоттинга [69].

  Вестерн-блоттинг

  Общий белок был разделен с помощью SDS-PAGE (10-15% трис-глицина), перенесен на нитроцеллюлозную мембрану Hybond (Amersham biosciences) и исследован антителами, специфичными для фосфо-STAT3 (S727) (ab32143, abcam) , фосфо-STAT3 (Y705) (9131, Cell Signaling Technology (CST)), STAT3 (124H6: 9139, CST), фосфо-NF-κB p65 (S536) (93h2; 3033, CST), NF-κB p65 (D14E12 ; 8242, CST), фосфо-Акт (T308) (244F9; 4056, CST), фосфо-Акт (S473) (D9E; 4060, CST), Akt (9272, CST), IL-6 (ab6672, abcam), HA (HA-7, Sigma H9658), GFP (B-2: sc-9996, SCBT) и GAPDH (G-9, SCBT).Вестерн-блоттинг визуализировали с помощью видоспецифичных вторичных антител, конъюгированных с HRP (Sigma) и ECL (Thermo / Pierce).

  Трансдукция ретровируса

  Вектор pLNCX AKT (Addgene, 9006) трансфицировали в клетки HEK293TT с оболочкой мышиного ретровируса и плазмидами GAG / полимеразы (любезно предоставлены профессором Грегом Тауэрсом, Университетский колледж Лондона) с использованием реагента для трансфекции PEI, как описано ранее [19] . Через 48 часов среду удаляли из клеток HEK293TT и добавляли к клеткам HeLa на 16 часов.По истечении этого времени вирус удаляли и заменяли DMEM, и клетки собирали через 48 часов после трансдукции.

  Количественная ПЦР в реальном времени

  Тотальную РНК экстрагировали с помощью E.Z.N.A. Total RNA Kit I (Omega Bio-Tek) в соответствии с протоколом производителя. Один мкг общей РНК обрабатывали ДНКазой в соответствии с протоколом RQ1 RNase-Free DNase (Promega), а затем подвергали обратной транскрипции смесью случайных праймеров и олиго (dT) праймеров с использованием qScriptTM cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) в соответствии с инструкциями.qRT-PCR выполняли с использованием набора QuantiFast SYBR Green PCR (Qiagen). Реакцию ПЦР проводили на Corbett Rotor-Gene 6000 (Qiagen) следующим образом: этап начальной активации в течение 10 мин при 95 ° C и трехступенчатый цикл денатурации (10 сек при 95 ° C), отжиг (15 сек при температуре 95 ° C). 60 ° C) и удлинение (20 секунд при 72 ° C), которое повторяли 40 раз и завершали анализом кривой плавления. Полученные данные анализировали по методу ΔΔC _t с использованием программы Rotor-Gene 6000 [70]. Для каждого проанализированного гена использовали специфические праймеры, которые показаны в таблице 1.U6 служил геном-нормализатором.

  Анализы репортера люциферазы

  Клетки высевали в 12-луночные чашки и на следующий день трансфицировали с использованием PEI репортерными плазмидами, экспрессирующими люциферазу светлячка под контролем промотора IL-6 или промотора ConA , который содержит тандемные повторы элемент κB-ответа [68, 71]. При необходимости клетки котрансфицировали плазмидами, экспрессирующими GFP или GFP-E6. Для нормализации эффективности трансфекции к каждой трансфекции добавляли репортерную плазмиду люциферазы pRLTK Renilla.Через 24 часа образцы лизировали в буфере для пассивного лизиса (Promega) и измеряли активность, используя систему анализа двойного люциферазы-репортера (Promega), как описано [72].

  Иммунофлуоресцентное окрашивание

  Клетки высевали на покровные стекла и через 24 часа трансфицировали при необходимости. Через 24 часа после трансфекции клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 10 минут, а затем пермеабилизировали 0,1% (об. / Об.) Тритоном в течение 15 минут. Затем клетки инкубировали с первичными антителами в PBS с 4% BSA в течение ночи при 4 ° C.Первичные антитела использовали в концентрации 1: 400. Клетки тщательно промывали PBS, а затем инкубировали с конъюгированными с Alex-fluor вторичными антителами 594 и Alexa 488 (1: 1000) (Invitrogen) в PBS с 4% BSA в течение 2 часов. DAPI использовался для визуализации ядер. Покровные стекла помещали на предметные стекла с помощью Prolong Gold (Invitrogen).

  ELISA

  ELISA человеческого IL-6 DuoSet ^® был приобретен у R&D Systems и использован в соответствии с инструкциями производителя.

  Анализ микроматрицы

  Для анализа микроматрицы был использован набор данных о 28 случаях рака шейки матки и 23 образцах нормальных образцов шейки матки. Данные микрочипа были получены из регистрационного номера базы данных GEO GSE9750.

  Статистический анализ

  Там, где указано, данные анализировали с использованием двустороннего непарного t-критерия Стьюдента. Обозначения к рисункам

  Дополнительный рисунок 1. Е6 HPV16 индуцирует экспрессию IL-6 . A) Клетки CaSKi трансфецировали siRNA, специфичной к Е6 HPV16, и анализировали экспрессию мРНК IL-6 с помощью qRT-PCR.Образцы были нормализованы по уровням мРНК U6. B) Репрезентативный вестерн-блот клеток CaSKi, трансфицированных пулом двух специфических миРНК против Е6 HPV16 и проанализированных на экспрессию IL-6. Нокдаун Е6 ВПЧ16 был подтвержден с использованием антитела против Е6 и р53 ВПЧ. GAPDH служил контролем загрузки. G) Клетки CaSKi трансфицировали пулом двух специфических миРНК против Е6 HPV16. Культуральную среду анализировали на белок IL-6 с помощью ELISA. Данные представляют не менее трех биологических независимых повторов.Столбики ошибок представляют собой среднее +/- стандартное отклонение минимум трех биологических повторов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 (t-критерий Стьюдента).

  Дополнительная фигура 2. Ингибирование NF-κB не влияет на передачу сигналов STAT3, опосредованную экзогенным IL-6 . A) C33A обрабатывали DMSO или IKKi или трансфицировали pcDNA или IκBm перед обработкой 20 нг / мл рекомбинантного человеческого IL-6 в течение 30 минут. Лизаты клеток анализировали на фосфорилированные и общие формы p65 и STAT3.GAPDH служил контролем загрузки. Данные представляют не менее трех биологических независимых повторов. B) C33A обрабатывали DMSO или IKKi или трансфицировали pcDNA или IκBm перед обработкой 20 нг / мл рекомбинантного человеческого IL-6 в течение 30 минут. Клетки анализировали иммунофлуоресцентным окрашиванием на общий STAT3 (зеленый) и контрастировали с DAPI для выделения ядер (синий на объединенных панелях). Масштабная линейка 20 мкм.

  Вклад авторов

  Задумал и спроектировал эксперименты: ELM и AM.Проведены эксперименты: ELM. Написал рукопись: ELM и AM. Критически проанализировал рукопись: ELM и AM.

  Благодарности

  Мы благодарны Уильяму Селлерсу за предоставление векторов экспрессии ретровирусов Akt через репозиторий Addgene. Мы благодарим шотландскую сеть исследователей ВПЧ (SHINE) и Шейлу Грэм (Университет Глазго) за предоставление образцов биопсии, положительных на ВПЧ. Мартин Стейси (Университет Лидса) предоставил помощь и реагенты для экспериментов ELISA, Дерек Манн (Университет Ньюкасла) и Рон Хэй (Университет Данди) предоставили плазмидные реагенты.

  No related posts.